科研求助!--(!)

kqyy

小弟是用人骨髓培养人的骨髓间充质干细胞的,效果很差.我取2-4毫升骨髓枸椽酸盐抗凝,种到25平方厘米的玻璃瓶中,48-72小时初次换液时几乎什么都没有.$ Y3 ]* ]; B; Z: ]' `8 m
      问题一:抗凝剂枸椽酸盐损伤细胞,导致细胞活力受损.
; G& M# j& E! z2 f; E& R     问题二:运输保存，我用一个泡沫保温盒子，里面没有加冰，估计里面的温度２０几度吧．
! A  H4 X2 P* D( a8 n5 \　　问题三：抽取的骨髓液太少，种的面积太大．２－４毫升种２５平方厘米的玻璃瓶．
6 F0 q3 R, B$ `/ x　问题四：血清浓度问题．我一直用ＤＭＥＭ＋进口１０％ｆｂｓ，有人建议我用１５％的血清，我曾经有一批用２０％的血清养出来了。2 ^* o; ^1 G1 s& }
　问题五：培养箱的原因。我一直在一个培养相养。里面肿瘤细胞和各种原代细胞都有人养，另外培养相的各种参数是否正确等。

宝贝一家亲

对于抗凝剂的影响我不太清楚/ ~/ m, p+ h; I- D
但是我可以给你后面几个问题 提出我的看法  希望对你有帮助
$ r$ Y; O/ d: J+ J: `; k运输保存最好是在冰上 而且最好拿到以后最短的时间里分离出细胞进行培养
% U8 z' o, `2 F2 R' v培基可以尝试提高血清至15%，另外我们一般养原代会添加非必需氨基酸 我不知道你们的培基里是否需要添加
4 G' X) k# P* c还有是否需要添加其他因子  u4 D) Q: H% X+ m' P
接种细胞密度也很关键 合适的密度 4 ]. v1 |6 L- \9 _
太稀的话细胞很难长起来 3 |& _6 \# C& D! t# Q; M
培养箱的话如果其他细胞培养都没有问题那么培养箱就没有问题

tnfsf10

回复 2# 宝贝一家亲 ; Y- `1 J( s$ ]9 H( c  D5 l

. `' G4 `" p# x& R8 V. k
5 x$ y+ x$ d) e! e% D" n    1.抗凝剂最好使用肝素钠抗凝。（12500U肝素钠/100ml生理盐水溶解）与骨髓1：1
9 n) v/ r& ~  U1 {6 H2.原代培养时候，骨髓分离出来的单个核细胞，一般建议2*10 5次方/cm2接种，24到48小时半量换液。一般来说，MCS贴壁很快的，不需要24小时。如果看到的很少，可能是MCS很少。我观察的48小时后可以明显看到纤维状细胞，换液的上清使用新的培养瓶培养，基本没有纤维状细胞出现。" O5 ^( {* h  }0 e; ]8 [
3.我现在的问题也是，原代细胞生长缓慢，不知道有没有好的方法加快细胞分裂。我没有添加生长因子的。6 v& Y9 W* _1 y( K
希望和大家一起学习！

烂桃

放置时间长会有影响，我做的首次半换液72h，原代的可以用15%FBS，我个人认为BMSC还是比较好养，抽出后时间长的话可以肝素钠抗凝，时间段就不需要，加培养液稀释离心，重悬接种后三天后半换液，在两三天全换液，差不多一个星期到十天左右就能长满，不过前几天最好不要经常拿出来看，会对细胞贴壁有影响，我一般前三天都不动它的

烂桃

2-3ml骨髓，主要用全骨髓贴壁，密度梯度离心也用过，但是形态不如全骨髓的好，10 8次方首次接种的话10cm的培养皿2×106\个，原代培养我有时加一些生长因子

5784630

回复 5# 烂桃
4 e8 g, C/ F: @* q, A3 @; i0 c2 Z/ u0 p! z* Z9 Q* C
! G. m7 c8 `) U( C; e7 C
    楼上，你好，能给我发一份全骨髓贴壁法的protocol吗？" L1 G: O! g' p8 {+ S1 u0 V
   我的QQ:1005139063
# G: P, V$ i& R. f    非常感谢

kqyy

请问版主"烂桃"的疑问:3 U# Y- B# q% l) i
1、关于抽取骨髓的体积的问题，多少毫升种多大的瓶。多大的密度种什么瓶。( C( C0 ?, Z# L- ~
2、培养基稀释是完全培养基还是基础培养基呢？