小鼠BMSC原代细胞贴壁太紧！！求助~~

angel-sakura

第一张图片是我消化前的，第二张图片是我消化14min后的（0.025%EDTA+0.25%胰蛋白酶），消化的结果和前2次消化的结果一样，只是把杂细胞消化下来了，BMSC还紧紧贴着，现在实在是没办法了，我们实验室的学长建议我把细胞刮下来。。。在此之前我想问一下各位消化小鼠BMSC是怎么消化的？胰蛋白酶的浓度是0.25%还是要高一些？EDTA的浓度是不是不够高？我也在消化后用枪吹打了。
9 `; g3 t4 \" X" B. @, F7 }) E' e6 ?- m% A+ y% D( A) t
4 e7 h. n" X% V. i7 w  F
* [( v" M4 s5 C2 G8 W
1 ]: W; j' R# X2 H6 ]$ h
此外，下面2长图片是我消化下来的细胞进行的传代培养1 K% n+ m1 w5 B6 f

! l; B/ t& s9 ~* r' v' }, N0 o2 I& H& q6 z' f1 C7 Y$ D
感觉不像是BMSC，更像杂细胞，但有人说先消化下来的是BMSC，杂细胞不容易消化下来。  ?  Q  B+ H; X0 {; H; B# X* [
不知道他们这样说的是养的大鼠吗？大鼠的BMSC好像是这样的。我养的是小鼠BMSC。。。

get0715

有两点建议：
0 V$ k2 T# K  _8 O; t5 e* Y0 j1.消化时，可先将所需要体积的胰酶预热一会，使其达到最佳状态的时候加入细胞瓶中消化。
0 N  n) z1 T, _6 g! k. S2.试试提高胰酶的浓度到0.5%，如果还是不行，就试试细胞刮吧。
8 ]2 R* e  o7 D: ?7 K2 J5 U; X" m$ P再者你的培养条件可能有些问题，BMSC消化不下来是细胞状态不佳，从根本上找找原因。

wiley

是否可以加点胶原酶？

wiley

细胞刮可能不适合，我试过，刮完之后绝大多数细胞会死亡。
! r: B* j& g3 l/ ]楼主就不要在乎还贴在细胞瓶上的残存细胞了，把消化下来的细胞接种到下一瓶培养看看，据说真正的MSC贴壁不会太紧。1 Y% s* S. }4 H4 b( P* H
另外不知楼主是否可以换一种培养基试试，好像有一家叫atlana公司的a-MEM培养基以及血清，我用过之后现在长得还好。现在非常容易消化。冻存之后生长状态也挺好

157238360jwj

我们实验室在做消化前，会先用注射器抽取适量胰酶放在培养箱中预热，大概5-8分钟左右，只要感觉胰酶有点温热就可以了，加入之后放入培养箱1-2分钟，镜下观察消化情况，不过一般都可以消化下来。。

angel-sakura

回复 2# get0715
9 T) E# B- i; m" _, s& e1 \5 O我消化的时候是放到培养箱中孵育的，我是第一次做BMSC的原代，操作上确实可能有问题，而且我养的BMSC5天就长满了。。。别人都起码一个星期不去动它

angel-sakura

回复 4# wiley " Z7 z* |3 s& t7 l) j
已经这样试过了，但消化下来的细胞不太像BMSC，更像杂细胞.

kqyy

一般加了EDTA就会很好消化了,但是伤细胞,你上面的细胞受损很厉害,的确是BMS,你i可以考虑酶和EDTA 的质量,估计是失效了.住你好运.

why121

间充质的特性是易消化和易贴壁 我也碰到和楼主一样的情况过 感觉形态像梭形的细胞很难消化下来 所以一直很纳闷

why121

楼主可以试下把PBS和胰酶都先放到37的孵箱里预热，然后用pbs洗的时候洗2-3次 每次都让它晃荡一会，然后控干一小会加入1.5ml左右的胰酶 试下2-3分钟消化下来的细胞 我最近感觉好像这样好像容易下来些（个人愚见） 请高手指教