向高手求助，ips慢病毒包装具体是怎么操作的？

zlx0814

7 B' k, u( k" \+ l- J1 e0 P' `2 \: q- N3 }/ |
新手上路，向高手求助，ips慢病毒包装具体是怎么操作的？多谢各位了？

pujixing

zlx0814同志问的问题其实是关于Lentivirus包装的。不同实验室可能会有不尽相同的protocol，这里仅根据个人经验写一个简便但可行的磷酸钙转染法。希望同行多多参与指正。1 [5 C6 ?- \/ f# h. Q9 @
其主要步骤如下：
; Z6 l: C* `$ {+ w  u; k1）Day1：传293T细胞，40~60%；
  v7 g# k- J4 k8 i. W- l; K: _2）Day2：转染前最好先换一次液（5ml即可）；9 A/ c+ v! f/ x5 k1 L) r* d
3）转染细胞，一般是Vector：delta8.2:VSVG的比例为5（或4）:3:2，对10cm dish，用的总质粒量不宜超过40ug（每个人的具体实验可以先摸索一下，一般20ug也就够了）；具体的试剂网上可以查到，这里不再写出。但主要的solution是2M CaCl2 （最好用SIgma的cell culture级别的，纯度不要低于97%）和2XHBSS；
1 \9 s: e, I1 e: V( A7 O4）对10cm dish来说，可以配制1ml工作液：即含有65ul 2M CaCl2，适量的质粒，并用MilliQ水补齐到500ul，混匀；
% s( R9 O/ g  j, X& o* m3 J5）向管中逐滴加入2XHBSS，然后用枪小心缓慢吹打若干次（个人习惯10次左右），静置10-20min（室温）；
/ z! p3 ^& U  n1 ~6）加入到前述铺有293T细胞的培养皿中，摇匀，多数情况下，镜下可看到细密均与的颗粒；) w! S# ^" j$ B6 r& n/ q; m
7）8hr后换液，这时可用PBS清洗掉过多的颗粒；
/ ~/ @' `- B; Y7 |3 e8）继续培养，收集转染后36hr，48hr，72hr（视具体细胞状态而定）等时间点的病毒上清。

开心果王

传一个iPSc general protocol给大家参考，有慢病毒和逆转录病毒包装步骤，包装细胞是293FT

daviehe

谢谢楼上

zlx0814

谢谢大家！！！

dl晗晗

谢谢
4 J6 S. ?4 L. V2 {1 _" Z3 _

wht_nmg

非常感谢

lemma710

非常感谢~
# O9 O" ~9 k" y

gact

三种病毒载体在ips效率上、包装上有什么不同？