向高手求助，ips慢病毒包装具体是怎么操作的？

zlx0814

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0 l3 E' |2 u9 w3 c9 z0 u' H. g# a新手上路，向高手求助，ips慢病毒包装具体是怎么操作的？多谢各位了？

pujixing

zlx0814同志问的问题其实是关于Lentivirus包装的。不同实验室可能会有不尽相同的protocol，这里仅根据个人经验写一个简便但可行的磷酸钙转染法。希望同行多多参与指正。
7 Q1 P2 ~" }# s6 M4 e其主要步骤如下：
( _9 Q2 W+ D4 X1）Day1：传293T细胞，40~60%；6 u& z0 K, M2 D( s# s+ \
2）Day2：转染前最好先换一次液（5ml即可）；: B/ P, k( g0 `
3）转染细胞，一般是Vector：delta8.2:VSVG的比例为5（或4）:3:2，对10cm dish，用的总质粒量不宜超过40ug（每个人的具体实验可以先摸索一下，一般20ug也就够了）；具体的试剂网上可以查到，这里不再写出。但主要的solution是2M CaCl2 （最好用SIgma的cell culture级别的，纯度不要低于97%）和2XHBSS；9 }2 {& u6 Y( O, A
4）对10cm dish来说，可以配制1ml工作液：即含有65ul 2M CaCl2，适量的质粒，并用MilliQ水补齐到500ul，混匀；
6 e0 R1 p3 c% D0 {5 D9 i, S5）向管中逐滴加入2XHBSS，然后用枪小心缓慢吹打若干次（个人习惯10次左右），静置10-20min（室温）；8 y' l2 `8 S! i; o# X. V. Z8 _6 f3 i
6）加入到前述铺有293T细胞的培养皿中，摇匀，多数情况下，镜下可看到细密均与的颗粒；- _$ _4 Q7 Y8 N7 X6 Y) y
7）8hr后换液，这时可用PBS清洗掉过多的颗粒；
8 C5 m5 }% `: f7 `( ]! a4 @8）继续培养，收集转染后36hr，48hr，72hr（视具体细胞状态而定）等时间点的病毒上清。

开心果王

传一个iPSc general protocol给大家参考，有慢病毒和逆转录病毒包装步骤，包装细胞是293FT

daviehe

谢谢楼上

zlx0814

谢谢大家！！！

dl晗晗

谢谢
! N" K& S8 H6 A4 ~5 z4 K

wht_nmg

非常感谢

lemma710

非常感谢~+ C+ M3 N! H/ [, E$ X8 t

gact

三种病毒载体在ips效率上、包装上有什么不同？