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先总结一下我的实验过程：
* S; n! p( A( }（1）2月龄兔，腹腔麻醉，穿刺取骨髓4ml.
4 `# }8 ]- o1 B& g, `（2）先与Gibco L-DMEM混合，离心2500r×10min，弃上清。2 `, G: i- O2 Z; A
（3）完全培养基（Gibco L-DMEM+10% Gibco FBS）混合沉淀，离心2500r×10min，弃上清。
* w% Z* K- M% a: z' U" a% N（4）沉淀分两个10cm培养盘，各加完全培养基10ml,5%CO2，37度培养。
9 m; ~0 c! a/ {, Y（5）五天后第一次换液，此后每两天换液。
3 K% B# p0 Z3 U' A, u
# p& h5 V# t0 a8 I# U( P' ]碰到问题如下：
) B1 n# d: z3 W（1）第一次换液观察，可见有梭形细胞出现，细胞呈极性伸展；也存在多角形细胞。
" g7 {2 v) A, M+ h. g5 X（2）第二次换液，可见有的细胞单个生长，有的形成克隆，但是各个克隆的细胞密度不一致，' |5 x7 B" V2 I* [ l5 X* `% \
有些密集，有些稀疏。
) c/ @( n( {' P' N& v（3）第三次换液后，稀疏的克隆里，细胞能保持清晰的边缘，立体感强。9 M g( m$ s! p: g _
密集的克隆里细胞非常“拥挤”，立体感变差。. D# e. ?& s& q8 K" G
（4）为了防止密集克隆里细胞过密生长，使用0.25%胰酶消化传代（未加EDTA，但细胞很容易消化），离心。. O$ B9 E1 |6 d/ ?
此时细胞还不能铺满单层。$ Z$ R/ e4 h4 A( f0 q6 L
（5）传代过夜后观察，细胞状态变差，铺展得很扁平（如图）。
% ?3 V `3 a k5 u% P0 K' ]6 I \9 Y8 i
0 O n! i% M1 ^7 m
, k. n+ \. ~. M6 A6 e4 k现在需要请教各位
8 G7 Y9 M" c) P% {# [5 g: q8 `9 h" n（1）为什么各个克隆的细胞密度会出现差异？
9 o) `* J& B2 c" e2 k1 J（2）为什么传代后细胞的状态与原代相比会变化这么大？
, s& S7 q6 u1 J0 t（3）原代细胞需要生长到什么状态，再进行传代比较好？
9 ^4 ^5 u! w( r 消化，传代操作有什么特别要注意的？
: b, n7 b" o v2 y5 E: c 有老师介绍说不用吹打，可以用刮，行不行？* u' s3 ]4 W) k& F8 }4 [
6 }' I# J3 Q2 R) @" u" v
谢谢各位了！ |
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发表于 2010-5-4 10:38
