MSCS诱导分化后的免疫细胞化学鉴定

bypw

前几天将诱导后的MSCS做了RT-PCR鉴定相关基因的表达情况，证明诱导可能成功了。接着实验应该要进行相关蛋白质的鉴定，我打算做免疫细胞荧光化学检测相关的蛋白表达，找了很久也没有找到一个详细的步骤，看了很多网站以后，总结出了其步骤，跟战友们分享，后天准备按照这个步骤做实验，大家也看看有什么问题没有.一起讨论一下。& j% {6 L  n) A9 t1 C& D

% M5 ~5 q0 |- m( A免疫细胞荧光化学技术的步骤:
# W( o% H/ Q) a9 \& D: F  b
$ C' ]3 _* s# I8 U5 o3 X; g; m   由于我对MSCS诱导时间比较长，是在6孔板上进行的，所以我就直接在六孔板上进行操作，不做细胞爬片。* M" Q4 i. N0 x
, r% @" x4 x3 \* W' f
1   细胞固定。用合适的有机溶剂如4%的多聚甲醛固定10min,室温。
0 S% F& ~. v2 g+ E: o* DPBS洗3次 ，5min/次., L  ^: O& R  K, z8 \4 l
2. 透膜。用0.2triton X-100，室温，10min.PBS
6 U1 W8 h9 A' B" o. F3 ]洗3次，5min/次.
1 y0 W0 P* g, x2 O  b# i; s& J3. 封闭抗原。用与二抗来源相同的同种血清（我的2抗是羊抗兔的，所以我选的是羊血清）。37℃，30min.孵育后不要洗（洗就没有封闭抗原的作用了）。8 J: i$ e8 i, [. u1 o  r7 u; U
6. 加入一定（或一定范围）抗体滴度的一抗，4℃过夜，第二天复温37℃，60min湿敷（超过30min需湿敷）。PBS洗3次，5min/次.; E% F0 ~. n+ m- S
7. 加入荧光标记的二抗，37℃，30min湿敷（超过30min需湿敷）。PBS洗3次，
; \2 F0 w* s. @% z! ?: K5min/次.
, \2 @* `1 S8 o/ I  m; d8. ，直接在荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察）观察。
0 V0 v' v' r0 i" o
% n- l! u3 p' }6 t这就是我打算用来做免疫细胞荧光化学技术的步骤，大家觉得有什么要修改的没有，指正一下

bypw

回答网友提问：   
3 |8 W9 r) C+ n7 U% Y  DAPI用的是10ug/ml 复染最后一步加入，7 i# w5 @/ Q; H' O0 {
  激光共聚焦是可以看的可以看孔板。; @1 v6 V& I8 |- x' a1 @
  为防止六孔板干掉，我是在周围没有用的孔与孔的间隙里加点蒸馏水，保持一下湿度。
7 C4 a% b1 z$ J+ I! J( D, m( {. `& V: @8 [   第二天复温37℃，60min湿敷（超过30min需湿敷）  这一步也主要是复温主要为了在下一步加抗体时能发挥更好的作用，  超过30min需湿敷主要是防止干燥，主要是在的孔与孔的间隙里加点蒸馏水。  t/ B% \! N. Q+ {/ w* O2 j- |
  这是我的回答，不对之处请战友们帮忙优化，谢谢，看了的帮帮点一点上面的  ”顶“。支持一下。

bypw

回复 14# fish619
* |% G. ?# r/ N/ F6 U" [
* V5 B& l, T3 `+ t& m, B' U6 B+ U% \  x% r5 f
    没有问题，可以看的

bypw

回复 16# duoduo777001 + q9 M& c* H  K. t' j& E4 w

. m& G. d8 i; B5 j) @- V& \不一定，你可以先做做看看啊