MSCS诱导分化后的免疫细胞化学鉴定

bypw

前几天将诱导后的MSCS做了RT-PCR鉴定相关基因的表达情况，证明诱导可能成功了。接着实验应该要进行相关蛋白质的鉴定，我打算做免疫细胞荧光化学检测相关的蛋白表达，找了很久也没有找到一个详细的步骤，看了很多网站以后，总结出了其步骤，跟战友们分享，后天准备按照这个步骤做实验，大家也看看有什么问题没有.一起讨论一下。
3 E  G+ o, M4 h3 x
, |" r' T( B1 e9 o免疫细胞荧光化学技术的步骤:
. k8 F: h  z1 r; a& [! i7 F) C: v+ Q" }9 k6 B9 ~! `6 p6 M$ s
   由于我对MSCS诱导时间比较长，是在6孔板上进行的，所以我就直接在六孔板上进行操作，不做细胞爬片。4 Q% z2 D( ]) R! C% |
) Y+ u* a% x& c  z: P
1   细胞固定。用合适的有机溶剂如4%的多聚甲醛固定10min,室温。
6 x% H& Q, i# x3 y, D6 SPBS洗3次 ，5min/次.! H" E* Z- g+ h4 _  I  |
2. 透膜。用0.2triton X-100，室温，10min.PBS
. R8 z  ]0 x# n! ?$ u) h% |洗3次，5min/次.
8 i7 \" A* v# K6 I4 w- t3. 封闭抗原。用与二抗来源相同的同种血清（我的2抗是羊抗兔的，所以我选的是羊血清）。37℃，30min.孵育后不要洗（洗就没有封闭抗原的作用了）。$ ?6 ]/ u7 ]9 f. d7 v, c
6. 加入一定（或一定范围）抗体滴度的一抗，4℃过夜，第二天复温37℃，60min湿敷（超过30min需湿敷）。PBS洗3次，5min/次.
! {- e; l7 }  A7 [/ n3 C8 o5 D7. 加入荧光标记的二抗，37℃，30min湿敷（超过30min需湿敷）。PBS洗3次，
0 @2 S: B6 A3 _# ^5min/次.3 R( h% _5 E6 b
8. ，直接在荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察）观察。3 h+ _& [. u+ P* ]: y
3 A+ m5 z; s5 w1 X
这就是我打算用来做免疫细胞荧光化学技术的步骤，大家觉得有什么要修改的没有，指正一下

qingyueqingfeng

我用固定30min，还有想请教一下你敷一抗后4度过夜，怎么保证六孔板不干？还有为什么要复温，直接下一步不可以吗

qingyueqingfeng

我用固定30min，还有想请教一下你敷一抗后4度过夜，怎么保证六孔板不干？还有为什么要复温，直接下一步不可以吗

cm11011

我的步骤和你差不多，但是triton-X我采用0.1%。细胞我采用爬片后鉴定，我觉得这样更节约抗体。对于楼主所说的湿敷，我不明白，可否请楼主说明一下如何操作？还有，4℃过夜后第二天复温益处是什么？

duoduo777001

我做的是脂肪的，步骤跟你有点不一样：
7 |% e9 u( b1 [4 `$ A8 W9 ~固定，3.5%PFA，30min# S  E! \. p1 P2 x
透膜，15min RT: Y5 ]6 X' D, o* B% {" R
封闭，1%BSA 1h RT dark
" g( t5 @5 b- P* ]加抗体之前我都洗了的
( m2 k6 }2 o0 j6 b: M过夜后，拿出来直接洗，在加2抗。
% |, y1 m8 I, i. q9 T最后加入DAPI 10ug/ml

Jocelyn

楼主是否需要考虑DAPI复染?

hawkyiger

回复 2# qingyueqingfeng
0 u, z7 M3 i1 |% h" z3 v' J8 O7 I; d4 [  s0 F5 ^
关于那个防止六孔板干掉，你可以用封口膜或其他东西封一下口，另外再在孔与孔的间隙里加点蒸馏水，保持一下湿度

lorey

我只做过一次，还没有经验，请教各位几个问题：
+ Y/ a- v5 `, p1、triton-X我们用的是0.3%的，哪个浓度更好呢？
0 z7 |8 E. h. i2、DAPI最佳工作浓度是多少啊？
8 ]. Y' E  Y4 Q# a# {3、我们的结果不是很亮，是因为一抗只孵育了一个小时还是因为二抗不太好呢？
8 I: E" N& V+ Z4 P; K- z4、有人说wash buffer最好是PBS+1%BSA，不知道有没有道理呢？

duoduo777001

回复 8# lorey ' x: m( V9 c. N: F$ W

3 E* Y) l. o. E6 h9 Z
# W! m  p. D* K# c/ Z" U' C6 r2 ]: F6 ^    wash buffer我一直都是用的1XPBS，DAPI用的是10ug/ml，做过孵育一个小时的，也做过过夜的，个人觉得过夜的效果好一点，但是理论上是两个都可以。另外我们DAPI洗过之后，会在用mounting solution固定。避光4°条件可以保存一个月。

yxp

弱问，激光共聚焦可以看孔板么？
* J! ]# a) I/ ]0 \
8 m8 @2 K0 g3 H0 v$ o' i* l我一直被告知不能看.....汗