MSCS诱导分化后的免疫细胞化学鉴定

bypw

前几天将诱导后的MSCS做了RT-PCR鉴定相关基因的表达情况，证明诱导可能成功了。接着实验应该要进行相关蛋白质的鉴定，我打算做免疫细胞荧光化学检测相关的蛋白表达，找了很久也没有找到一个详细的步骤，看了很多网站以后，总结出了其步骤，跟战友们分享，后天准备按照这个步骤做实验，大家也看看有什么问题没有.一起讨论一下。  N4 q# k# c* u

& |# e/ _( s, V1 t8 M0 c& y免疫细胞荧光化学技术的步骤:
, {" x# V! r# @$ Y. d' x6 T, V! _7 W& a6 H1 f' c/ n4 K* q7 u
   由于我对MSCS诱导时间比较长，是在6孔板上进行的，所以我就直接在六孔板上进行操作，不做细胞爬片。3 Q! F: V& d, X. C: G8 i! w% U

0 E7 D+ @2 Q- A3 e& A' ?: B% v1   细胞固定。用合适的有机溶剂如4%的多聚甲醛固定10min,室温。
" Q* c2 y( z0 a  I+ H8 i$ lPBS洗3次 ，5min/次.1 P+ ~5 c* E+ C. Q( C8 X9 s
2. 透膜。用0.2triton X-100，室温，10min.PBS
, F) q# O  y; j9 e洗3次，5min/次.
3 I. \; J! K- _, K' z8 H: t3. 封闭抗原。用与二抗来源相同的同种血清（我的2抗是羊抗兔的，所以我选的是羊血清）。37℃，30min.孵育后不要洗（洗就没有封闭抗原的作用了）。
) h" K# \8 K' l8 x& B6. 加入一定（或一定范围）抗体滴度的一抗，4℃过夜，第二天复温37℃，60min湿敷（超过30min需湿敷）。PBS洗3次，5min/次.2 }& e- N4 u' }4 x9 a
7. 加入荧光标记的二抗，37℃，30min湿敷（超过30min需湿敷）。PBS洗3次，" W0 }- ]4 I) @
5min/次.) W) U5 k/ x: x
8. ，直接在荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察）观察。
1 {% o( M' l8 \2 X
4 n' l# c' Y0 {" e1 |3 n+ Z这就是我打算用来做免疫细胞荧光化学技术的步骤，大家觉得有什么要修改的没有，指正一下

qingyueqingfeng

我用固定30min，还有想请教一下你敷一抗后4度过夜，怎么保证六孔板不干？还有为什么要复温，直接下一步不可以吗

qingyueqingfeng

我用固定30min，还有想请教一下你敷一抗后4度过夜，怎么保证六孔板不干？还有为什么要复温，直接下一步不可以吗

cm11011

我的步骤和你差不多，但是triton-X我采用0.1%。细胞我采用爬片后鉴定，我觉得这样更节约抗体。对于楼主所说的湿敷，我不明白，可否请楼主说明一下如何操作？还有，4℃过夜后第二天复温益处是什么？

duoduo777001

我做的是脂肪的，步骤跟你有点不一样：
  K8 {, f* J2 c; t6 n固定，3.5%PFA，30min) c9 \; Y  z. d, s% p9 u( H) e) O
透膜，15min RT9 j' w( J8 j# O( v0 ?! E
封闭，1%BSA 1h RT dark
0 W  o2 S. P; G+ f加抗体之前我都洗了的
+ h# d2 f( N; l; c! a' j过夜后，拿出来直接洗，在加2抗。
( O3 |+ o: W0 u, f% i4 S最后加入DAPI 10ug/ml

Jocelyn

楼主是否需要考虑DAPI复染?

hawkyiger

回复 2# qingyueqingfeng
& l/ P% ]2 ^  K7 Q' B
; v- l) X# V; R1 A6 R+ r; C. s2 X关于那个防止六孔板干掉，你可以用封口膜或其他东西封一下口，另外再在孔与孔的间隙里加点蒸馏水，保持一下湿度

lorey

我只做过一次，还没有经验，请教各位几个问题：
  I3 `* W% r, x* s1、triton-X我们用的是0.3%的，哪个浓度更好呢？3 k/ Z& r. i+ ^; t/ L& B: s; T4 J
2、DAPI最佳工作浓度是多少啊？
3 b& ~1 p' f# P; q# v3、我们的结果不是很亮，是因为一抗只孵育了一个小时还是因为二抗不太好呢？
+ w6 r+ ]1 H* K' t) x4、有人说wash buffer最好是PBS+1%BSA，不知道有没有道理呢？

duoduo777001

回复 8# lorey
: ]2 E9 @; |) F3 u2 V+ ~5 e, t3 ?' J1 `$ H. k  D
. Y: X$ D# c( r! a1 r  M4 W# e
    wash buffer我一直都是用的1XPBS，DAPI用的是10ug/ml，做过孵育一个小时的，也做过过夜的，个人觉得过夜的效果好一点，但是理论上是两个都可以。另外我们DAPI洗过之后，会在用mounting solution固定。避光4°条件可以保存一个月。

yxp

弱问，激光共聚焦可以看孔板么？0 J: ]2 o1 F; K
" c4 X  w; Z& |+ `/ L
我一直被告知不能看.....汗