MSCS诱导分化后的免疫细胞化学鉴定

bypw

前几天将诱导后的MSCS做了RT-PCR鉴定相关基因的表达情况，证明诱导可能成功了。接着实验应该要进行相关蛋白质的鉴定，我打算做免疫细胞荧光化学检测相关的蛋白表达，找了很久也没有找到一个详细的步骤，看了很多网站以后，总结出了其步骤，跟战友们分享，后天准备按照这个步骤做实验，大家也看看有什么问题没有.一起讨论一下。) w! h- O/ `6 r' v: W: a

  o- R( g& S5 A+ B# X免疫细胞荧光化学技术的步骤:
/ m- `( G" O: a/ F
" f7 {7 G' E$ {$ H0 N   由于我对MSCS诱导时间比较长，是在6孔板上进行的，所以我就直接在六孔板上进行操作，不做细胞爬片。+ A2 s/ {# Q6 j0 ?
& a' @) d7 J" l
1   细胞固定。用合适的有机溶剂如4%的多聚甲醛固定10min,室温。
, F5 `  N% b/ H% ~+ T# S) J. @9 sPBS洗3次 ，5min/次.; ]! y) S/ _* X; T7 J4 M
2. 透膜。用0.2triton X-100，室温，10min.PBS  ~9 f5 s6 B! C$ X
洗3次，5min/次.
$ w( G& i% c: E% s/ j7 Y" |3. 封闭抗原。用与二抗来源相同的同种血清（我的2抗是羊抗兔的，所以我选的是羊血清）。37℃，30min.孵育后不要洗（洗就没有封闭抗原的作用了）。% u8 j# O; t  ?$ ~# d
6. 加入一定（或一定范围）抗体滴度的一抗，4℃过夜，第二天复温37℃，60min湿敷（超过30min需湿敷）。PBS洗3次，5min/次.
2 A% Z. N5 V' D- K5 C7. 加入荧光标记的二抗，37℃，30min湿敷（超过30min需湿敷）。PBS洗3次，
/ ]7 J! L( i' x7 Q5min/次.6 o4 P( t0 b8 y& D* g: \8 @3 X
8. ，直接在荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察）观察。. W, H; U$ s9 O
1 W( O# h4 y# V% e* S
这就是我打算用来做免疫细胞荧光化学技术的步骤，大家觉得有什么要修改的没有，指正一下

qingyueqingfeng

我用固定30min，还有想请教一下你敷一抗后4度过夜，怎么保证六孔板不干？还有为什么要复温，直接下一步不可以吗

qingyueqingfeng

我用固定30min，还有想请教一下你敷一抗后4度过夜，怎么保证六孔板不干？还有为什么要复温，直接下一步不可以吗

cm11011

我的步骤和你差不多，但是triton-X我采用0.1%。细胞我采用爬片后鉴定，我觉得这样更节约抗体。对于楼主所说的湿敷，我不明白，可否请楼主说明一下如何操作？还有，4℃过夜后第二天复温益处是什么？

duoduo777001

我做的是脂肪的，步骤跟你有点不一样：
8 f7 U/ p9 ^3 k/ T固定，3.5%PFA，30min
1 f7 K- L$ X( f# ~( `2 Z透膜，15min RT
5 V& t" u5 K% p3 O5 I- s3 R$ {封闭，1%BSA 1h RT dark$ D( E. M. V) ~8 Y+ g
加抗体之前我都洗了的
$ d2 V0 b5 a, g/ r' b4 n5 h) T过夜后，拿出来直接洗，在加2抗。
' y" W2 v; r- @( C$ Y  L, [  D! m$ x最后加入DAPI 10ug/ml

Jocelyn

楼主是否需要考虑DAPI复染?

hawkyiger

回复 2# qingyueqingfeng
( W! c8 u0 I6 R  i+ U0 U: l3 o/ `8 y6 N, Q: E# a& ^% e! e1 }. z
关于那个防止六孔板干掉，你可以用封口膜或其他东西封一下口，另外再在孔与孔的间隙里加点蒸馏水，保持一下湿度

lorey

我只做过一次，还没有经验，请教各位几个问题：# C8 R+ p8 K& S4 L( |' k5 z! Q
1、triton-X我们用的是0.3%的，哪个浓度更好呢？2 I9 |( ]' @3 Q, k% i
2、DAPI最佳工作浓度是多少啊？- e2 U5 K) A( J6 s0 V+ y
3、我们的结果不是很亮，是因为一抗只孵育了一个小时还是因为二抗不太好呢？1 x& J5 l* \* I# \) E+ W; k6 L0 H
4、有人说wash buffer最好是PBS+1%BSA，不知道有没有道理呢？

duoduo777001

回复 8# lorey
6 l; h/ h$ M! W) r1 q: t1 L+ I7 I& ^& n

( x( z) A) e+ f3 c7 |: ?    wash buffer我一直都是用的1XPBS，DAPI用的是10ug/ml，做过孵育一个小时的，也做过过夜的，个人觉得过夜的效果好一点，但是理论上是两个都可以。另外我们DAPI洗过之后，会在用mounting solution固定。避光4°条件可以保存一个月。

yxp

弱问，激光共聚焦可以看孔板么？
+ l( K+ J9 \" y0 f5 P% _
% a% W4 ]! @" |1 G/ ~% S" ~0 |我一直被告知不能看.....汗