MSCS诱导分化后的免疫细胞化学鉴定

bypw

回答网友提问：    9 s( k, q5 g; n
  DAPI用的是10ug/ml 复染最后一步加入，
- t/ k8 H; r  K: u# V5 L  激光共聚焦是可以看的可以看孔板。$ z% j3 u8 x& X# B* {! Y3 Q
  为防止六孔板干掉，我是在周围没有用的孔与孔的间隙里加点蒸馏水，保持一下湿度。
% J% H7 J! y2 Z   第二天复温37℃，60min湿敷（超过30min需湿敷）  这一步也主要是复温主要为了在下一步加抗体时能发挥更好的作用，  超过30min需湿敷主要是防止干燥，主要是在的孔与孔的间隙里加点蒸馏水。3 ^/ C& F& @( i7 q4 |+ n
  这是我的回答，不对之处请战友们帮忙优化，谢谢，看了的帮帮点一点上面的  ”顶“。支持一下。

qingyueqingfeng

回复 7# hawkyiger
* o' Z, \* P$ Z( q. t) b) q0 S6 v3 e
谢谢，学习了，这是我一直以来的疑问

lorey

回复 9# duoduo777001
. g' n6 s% H0 e7 g8 t, H+ m' ^' `4 Q% O9 P1 S

# S7 s+ n2 P3 |) |    呵呵，谢谢答复

fish619

六孔板好像太厚了，好像不能在荧光显微镜下看吧，我一般是在六孔板里放入盖玻片后爬片后再做免疫荧光，固定后粘到载玻片上

bypw

回复 14# fish619 4 X- I% F) O. N( v
$ t  s. Q5 d9 Q" t* A" d
7 Q* k* }7 c' n
    没有问题，可以看的

duoduo777001

回复 1# bypw
  b. \, U8 F/ ~' m* E# {
: {2 `1 @. U! c9 W2 O* K6 V) _( q  E
    请问是不是一定要湿敷

yanxuebo1979

免疫荧光标准详细步骤：
3 D# @: t& N. b, @: v) X% i( i& g. x/ L1 ~0 |% {" }
①各组细胞以1×l05/L的细胞密度接种于6孔板中的爬片上，待细胞生长至70%融合时取出爬片。
; e& B5 ~  g4 F" X4 F②4℃丙酮固定爬片20min，0.0lmol/L的PBS(pH7.4)洗涤细胞爬片3min，2次。
) S3 v' P! Y1 j# r& A6 {( W③滴加封闭液，室温20min，PBS振洗，3min，2次。" F* f# s  P9 x6 ~$ c  T# m
④0.1%的Triton-X100孵育10min后，增强膜的通透性，PBS振洗，5min，4次。
. |% k2 l0 y; b2 F8 E; G+ m: T4 g⑤滴加鼠抗一抗工作液，37℃孵育1h，PBS振洗，3min，3次。# G1 m$ o* `2 _6 F3 {: U- \
⑥滴加生物素标记的羊抗鼠IgG，室温20min，PBS振洗，3min，3次。) }- ~8 e+ ]- @& U  n
⑦滴加链霉亲和素-生物素-过氧化物酶(SACB)，室温20min，PBS振洗，smin，4次。
1 |0 n/ G; A0 ~) {$ f⑧滴加DAB显色剂30min，自来水冲洗。) B  Y1 m! \  g8 u: ]) ]4 t
⑨苏木素复染30s，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。3 k: J8 ~7 m) V- Y( `
⑩荧光显微镜观察，拍照。

bypw

回复 16# duoduo777001 , W9 h7 v2 d" n7 @
0 a5 t$ G* g3 |7 ~( ^* A1 u) ?
不一定，你可以先做做看看啊

dingyx2009

回复 17# yanxuebo1979 & h3 B( h3 N% O/ |% c
4 h# U6 H' W$ G, R, V' V. \0 z
* j2 h* Y5 @; G
    回复yanxuebo1979：3 F; P0 R9 h6 p0 X+ c  E0 \; k, S
两种方法都可以的。你说的是三步法，楼上的是两步法，更方便简单。我们实验室都用两步法。结果很好。只是略有不同，细胞固定我们多用30分钟，以防后面洗脱掉。入trition-X后，可以不洗，直接加一抗。至于湿敷，最简便的就是放入湿盒中，肯定不会干。自制湿盒，可以取一能放板子的饭盒，在饭盒的底部放上湿的纱布，在放上板子，盖好饭盒即可。