MSCS诱导分化后的免疫细胞化学鉴定

bypw

回答网友提问：    ; i5 H$ A- A, p
  DAPI用的是10ug/ml 复染最后一步加入，
; `. M# V( k: e0 N* ]  激光共聚焦是可以看的可以看孔板。
# @  u+ d5 Z1 U# M3 i  为防止六孔板干掉，我是在周围没有用的孔与孔的间隙里加点蒸馏水，保持一下湿度。
$ Q1 P6 J, @1 J( p   第二天复温37℃，60min湿敷（超过30min需湿敷）  这一步也主要是复温主要为了在下一步加抗体时能发挥更好的作用，  超过30min需湿敷主要是防止干燥，主要是在的孔与孔的间隙里加点蒸馏水。: w3 R, Y7 {- }; s
  这是我的回答，不对之处请战友们帮忙优化，谢谢，看了的帮帮点一点上面的  ”顶“。支持一下。

qingyueqingfeng

回复 7# hawkyiger - K; n; y2 a# K" v( v7 m2 W

- P, a3 r- ?- n( i谢谢，学习了，这是我一直以来的疑问

lorey

回复 9# duoduo777001 & _# T! ?3 c4 j' i
6 N$ |% G! \0 V0 S5 P7 O

3 g" ?# p/ t0 I& F0 l) p    呵呵，谢谢答复

fish619

六孔板好像太厚了，好像不能在荧光显微镜下看吧，我一般是在六孔板里放入盖玻片后爬片后再做免疫荧光，固定后粘到载玻片上

bypw

回复 14# fish619
# B' `) k+ p) g/ c( `, s; q/ h# E4 B% K) K

3 r% n5 D1 a) S5 b! ?$ y; F( E    没有问题，可以看的

duoduo777001

回复 1# bypw
$ O8 q" `( [- [
% X+ e; u. C/ q, c8 y% y; W$ \: V1 X( F' Z& p9 m# V) c! d
    请问是不是一定要湿敷

yanxuebo1979

免疫荧光标准详细步骤：
+ T4 J  D, `) v: W0 M- \3 _- ]! F- O3 n1 V: t0 q- }
①各组细胞以1×l05/L的细胞密度接种于6孔板中的爬片上，待细胞生长至70%融合时取出爬片。
! R( n; y. A$ n- q②4℃丙酮固定爬片20min，0.0lmol/L的PBS(pH7.4)洗涤细胞爬片3min，2次。
  W( k1 ~$ o; m! A③滴加封闭液，室温20min，PBS振洗，3min，2次。
: ]1 B4 e( i! A0 U* d8 ~$ B④0.1%的Triton-X100孵育10min后，增强膜的通透性，PBS振洗，5min，4次。
  ?, `% N2 W% _5 N* r⑤滴加鼠抗一抗工作液，37℃孵育1h，PBS振洗，3min，3次。3 u" U% h0 v: O8 {& @/ a; s
⑥滴加生物素标记的羊抗鼠IgG，室温20min，PBS振洗，3min，3次。8 G9 @9 N& S! O4 Z, ~
⑦滴加链霉亲和素-生物素-过氧化物酶(SACB)，室温20min，PBS振洗，smin，4次。1 F3 Q7 T8 X$ b
⑧滴加DAB显色剂30min，自来水冲洗。7 q# P3 O$ J: U/ u2 J" j3 ~; T# H
⑨苏木素复染30s，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
' ?  z, Q! u9 k& j, C7 E5 U( M⑩荧光显微镜观察，拍照。

bypw

回复 16# duoduo777001
8 x3 R; ?3 h* j5 \- }2 O" F1 @! J1 ^( d8 m$ F  ~7 X6 q5 P
不一定，你可以先做做看看啊

dingyx2009

回复 17# yanxuebo1979 $ }/ T9 J" R- C" O/ q: Y/ l
- Q, B0 g% T) ~1 G7 u. I+ J
/ X) b5 V% p4 p
    回复yanxuebo1979：1 G, a$ ]9 a0 j8 E7 A
两种方法都可以的。你说的是三步法，楼上的是两步法，更方便简单。我们实验室都用两步法。结果很好。只是略有不同，细胞固定我们多用30分钟，以防后面洗脱掉。入trition-X后，可以不洗，直接加一抗。至于湿敷，最简便的就是放入湿盒中，肯定不会干。自制湿盒，可以取一能放板子的饭盒，在饭盒的底部放上湿的纱布，在放上板子，盖好饭盒即可。