MSCS诱导分化后的免疫细胞化学鉴定

bypw

回答网友提问：   
1 D/ o# r; S6 [' v, {+ Q* ^  DAPI用的是10ug/ml 复染最后一步加入，& I" R& c+ `/ t- k
  激光共聚焦是可以看的可以看孔板。
0 v) @) J& f7 t  为防止六孔板干掉，我是在周围没有用的孔与孔的间隙里加点蒸馏水，保持一下湿度。
7 ]( a  T, G; }8 S9 v( n; I   第二天复温37℃，60min湿敷（超过30min需湿敷）  这一步也主要是复温主要为了在下一步加抗体时能发挥更好的作用，  超过30min需湿敷主要是防止干燥，主要是在的孔与孔的间隙里加点蒸馏水。
: Z% o: t- I8 a9 v6 k( N  这是我的回答，不对之处请战友们帮忙优化，谢谢，看了的帮帮点一点上面的  ”顶“。支持一下。

qingyueqingfeng

回复 7# hawkyiger
- v  Y; `6 i* u* _3 K  Y0 F" Q& V5 \$ ~4 h1 |
谢谢，学习了，这是我一直以来的疑问

lorey

回复 9# duoduo777001 5 Q+ M8 }0 f2 F/ i
- f0 G: c9 ]& M
6 M5 F0 \$ v/ `" Z! ~: y. d
    呵呵，谢谢答复

fish619

六孔板好像太厚了，好像不能在荧光显微镜下看吧，我一般是在六孔板里放入盖玻片后爬片后再做免疫荧光，固定后粘到载玻片上

bypw

回复 14# fish619 3 M: |3 G0 s  ^. O' V, i
, m3 z* n# f4 x# g
* t0 C' V  ?1 v8 Z) y& i
    没有问题，可以看的

duoduo777001

回复 1# bypw , ?# D$ x4 K4 O! I( p

7 x7 C, L& I7 H* K, b2 L
! \: D! p+ f; f, o& W7 J4 h/ Q* k, B    请问是不是一定要湿敷

yanxuebo1979

免疫荧光标准详细步骤：; b4 f. T5 y4 v4 L% N
: T$ i1 s# v4 q& m
①各组细胞以1×l05/L的细胞密度接种于6孔板中的爬片上，待细胞生长至70%融合时取出爬片。4 D* S6 e9 M& _0 s/ l
②4℃丙酮固定爬片20min，0.0lmol/L的PBS(pH7.4)洗涤细胞爬片3min，2次。
6 A5 g8 C( x$ _. W③滴加封闭液，室温20min，PBS振洗，3min，2次。. Z6 {+ e$ V2 s) w) n9 `
④0.1%的Triton-X100孵育10min后，增强膜的通透性，PBS振洗，5min，4次。' K6 d* @& m3 F! d3 t" ?5 ]
⑤滴加鼠抗一抗工作液，37℃孵育1h，PBS振洗，3min，3次。
5 F5 G4 o2 E! @* u. R. x⑥滴加生物素标记的羊抗鼠IgG，室温20min，PBS振洗，3min，3次。
- s: g  T( s: x4 t5 e* ^2 l⑦滴加链霉亲和素-生物素-过氧化物酶(SACB)，室温20min，PBS振洗，smin，4次。
( K: ^6 e' h4 g5 D⑧滴加DAB显色剂30min，自来水冲洗。# D) @" m) z% q- Q# _
⑨苏木素复染30s，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
8 [* C* R) I" x# u. n9 p⑩荧光显微镜观察，拍照。

bypw

回复 16# duoduo777001 9 ~, ]1 u4 F+ ^4 \1 X  A9 L4 W( m
9 Q. n4 N* S  |- c! f: u4 t
不一定，你可以先做做看看啊

dingyx2009

回复 17# yanxuebo1979 & L3 k# S0 q% ^4 k* u4 X* j

, q. O0 E4 q8 v& `% H
0 j; D' g5 j( J% X2 t! T4 Y- e    回复yanxuebo1979：+ T6 D2 i/ y7 C- ]; s8 s' V# G
两种方法都可以的。你说的是三步法，楼上的是两步法，更方便简单。我们实验室都用两步法。结果很好。只是略有不同，细胞固定我们多用30分钟，以防后面洗脱掉。入trition-X后，可以不洗，直接加一抗。至于湿敷，最简便的就是放入湿盒中，肯定不会干。自制湿盒，可以取一能放板子的饭盒，在饭盒的底部放上湿的纱布，在放上板子，盖好饭盒即可。