MSCS诱导分化后的免疫细胞化学鉴定

bypw

前几天将诱导后的MSCS做了RT-PCR鉴定相关基因的表达情况，证明诱导可能成功了。接着实验应该要进行相关蛋白质的鉴定，我打算做免疫细胞荧光化学检测相关的蛋白表达，找了很久也没有找到一个详细的步骤，看了很多网站以后，总结出了其步骤，跟战友们分享，后天准备按照这个步骤做实验，大家也看看有什么问题没有.一起讨论一下。
/ t; T1 g$ T$ V: H5 Y9 U7 g  }( W* n. H0 F) `) C
免疫细胞荧光化学技术的步骤:
0 O. S- v7 ?: g- C# Q# ~) l4 Q1 K& s: z
; R5 V/ V$ U" _; S% K& |" f   由于我对MSCS诱导时间比较长，是在6孔板上进行的，所以我就直接在六孔板上进行操作，不做细胞爬片。
; H9 F' V4 r+ g& n" U5 h
$ D5 h4 J1 G0 z9 R+ l+ [( [/ {) \1   细胞固定。用合适的有机溶剂如4%的多聚甲醛固定10min,室温。6 a: Y' E9 X% u. j7 k( a; t
PBS洗3次 ，5min/次.
5 U4 l7 F1 n8 s: K# d8 \2 Q# u2. 透膜。用0.2triton X-100，室温，10min.PBS+ O7 M' Y! s; T$ `( \* A8 s5 h/ c
洗3次，5min/次.! I7 ~: b) @. w, P1 U+ J, p9 C
3. 封闭抗原。用与二抗来源相同的同种血清（我的2抗是羊抗兔的，所以我选的是羊血清）。37℃，30min.孵育后不要洗（洗就没有封闭抗原的作用了）。
/ u0 S7 Q7 @) K6. 加入一定（或一定范围）抗体滴度的一抗，4℃过夜，第二天复温37℃，60min湿敷（超过30min需湿敷）。PBS洗3次，5min/次.# h- c" D3 N' V0 }% E
7. 加入荧光标记的二抗，37℃，30min湿敷（超过30min需湿敷）。PBS洗3次，
, i- I$ `; P, _! i  _5min/次.
. D; v) u- T. ?* K/ Z* v3 y' M+ E8. ，直接在荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察）观察。$ J8 F# S2 F! e

1 O/ W* y, d" y3 Y这就是我打算用来做免疫细胞荧光化学技术的步骤，大家觉得有什么要修改的没有，指正一下

dingyx2009

回复 17# yanxuebo1979
/ U/ B3 h, h: M+ @5 k+ l; m
& m- `# ]2 Q1 ~8 I+ W1 d. m, J5 D; I+ C: c# b% W, r5 w4 i
    回复yanxuebo1979：) O! I* L# H4 ?2 U5 J
两种方法都可以的。你说的是三步法，楼上的是两步法，更方便简单。我们实验室都用两步法。结果很好。只是略有不同，细胞固定我们多用30分钟，以防后面洗脱掉。入trition-X后，可以不洗，直接加一抗。至于湿敷，最简便的就是放入湿盒中，肯定不会干。自制湿盒，可以取一能放板子的饭盒，在饭盒的底部放上湿的纱布，在放上板子，盖好饭盒即可。

bypw

回复 16# duoduo777001 ; a+ O; _6 \! v& ?9 W
3 V! x3 e  o! F/ v
不一定，你可以先做做看看啊

yanxuebo1979

免疫荧光标准详细步骤：0 H# ~1 o( Z' y5 f. g' u; f! w9 Y  ^4 P

' h) d- y  P* ^$ l! H8 }; d①各组细胞以1×l05/L的细胞密度接种于6孔板中的爬片上，待细胞生长至70%融合时取出爬片。
2 M( y2 ]6 s9 M4 P& g* B7 G②4℃丙酮固定爬片20min，0.0lmol/L的PBS(pH7.4)洗涤细胞爬片3min，2次。
3 M9 M$ I/ A, [$ d③滴加封闭液，室温20min，PBS振洗，3min，2次。$ s% y4 R2 i& V+ Q  J/ w
④0.1%的Triton-X100孵育10min后，增强膜的通透性，PBS振洗，5min，4次。. N7 N% W' I6 ^* p) x% _. |
⑤滴加鼠抗一抗工作液，37℃孵育1h，PBS振洗，3min，3次。
3 I% f' ]0 a( C. M/ u7 t* h⑥滴加生物素标记的羊抗鼠IgG，室温20min，PBS振洗，3min，3次。
- M# a* G9 m7 n* v6 ?, ^3 b⑦滴加链霉亲和素-生物素-过氧化物酶(SACB)，室温20min，PBS振洗，smin，4次。
, g" H. N. ]5 b! Y+ s2 t⑧滴加DAB显色剂30min，自来水冲洗。
7 P8 D& ?- ^/ G& ?. q⑨苏木素复染30s，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。2 V- a. f/ g+ n
⑩荧光显微镜观察，拍照。

duoduo777001

回复 1# bypw
; n0 e% I- O3 @8 z7 \% B4 ~/ Q' ~& n3 ]7 y/ ~2 ?! s; L0 Q$ C

1 z% o8 v4 n1 {# \% _' b9 I    请问是不是一定要湿敷

bypw

回复 14# fish619   M8 p7 W$ O4 F3 T: w
% I# i' w! ~8 j
0 r5 P0 X  }1 J6 r* A- L+ y
    没有问题，可以看的

fish619

六孔板好像太厚了，好像不能在荧光显微镜下看吧，我一般是在六孔板里放入盖玻片后爬片后再做免疫荧光，固定后粘到载玻片上

lorey

回复 9# duoduo777001 * X: T# ]4 n  X. W/ ^

3 T1 H7 J/ M1 s/ b: ~8 P$ v5 A9 A5 o8 D
    呵呵，谢谢答复

qingyueqingfeng

回复 7# hawkyiger
; v: N2 I8 Z8 i& a+ U' s0 C  K' N3 F  }
谢谢，学习了，这是我一直以来的疑问

bypw

回答网友提问：   
9 h4 t/ n3 x9 [8 f  DAPI用的是10ug/ml 复染最后一步加入，& X/ _) y# ]* z. f" l" I
  激光共聚焦是可以看的可以看孔板。" I' u1 }: s: Z+ C
  为防止六孔板干掉，我是在周围没有用的孔与孔的间隙里加点蒸馏水，保持一下湿度。+ ^( Y4 ?) S& Y& g+ c
   第二天复温37℃，60min湿敷（超过30min需湿敷）  这一步也主要是复温主要为了在下一步加抗体时能发挥更好的作用，  超过30min需湿敷主要是防止干燥，主要是在的孔与孔的间隙里加点蒸馏水。
. L  F& w  M  o* ^  ~2 }  这是我的回答，不对之处请战友们帮忙优化，谢谢，看了的帮帮点一点上面的  ”顶“。支持一下。