请教如何设计引物，以便用PCR的方法检测外源基因的表达

runsong

我将一个基因用慢病毒载pMSCV体转染细胞，现在想设计一引物检测此外源基因的表达。要遵从何原则，望前辈不吝赐教。

xiangchou812

还是以你的目的基因为模板，设计引物，先鉴定一下筛选的克隆里有无目的基因整合。
' g4 T: U& ]7 w0 [/ N然后以目的基因cDNA为模板，在设计一对引物，提取总RNA反转录检测目的基因表达与否。

POPOLD

流式 定量 免疫组化 western walking southern

xiangchou812

一般都是先做RT-PCR来检测mRNA有无，然后去做免疫荧光或western检测蛋白表达。

shihuijunm

实时监测量的多少，最好用实时荧光定量PCR，设计引物可以在网上收索到

绿雪

回复 6# zhanghuabing11 4 I3 v; o  l) \' y

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8 [/ r% J, F. Y% {" D. F    检测不到目标蛋白的表达？用什么方法检测的呢？在什么宿主表达呢？确认阅读框正确吗？
$ B: ]* Y; ?9 G, `   能否把问题说得明白点，大家才能给些建议啊。

zhanghuabing11

我们构建的转基因载体在体外检测不到目标蛋白表达，是怎么回事？做转基因动物需要在体外进行检测吗？谢谢！

念想儿

一般的操作都是转染之后的细胞单克隆化吧，之后再设计引物RT-PCR检测以及48h后收细胞做western吧

hndxws

同意楼上的意见，应该是用做于RT的，拿未转染的作对照。如果有这个表达产物的抗体，就直接时间梯度收样，做western，这样比较直接。

绿雪

是RT-PCR检测mRNA水平的表达吗？根据你的基因序列设计特异性引物就可以了。