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- 威望
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1．1个6cmdish的人ES细胞生长最旺盛的一天，在培养液中加入终浓度为100ug/ul的秋水仙碱，37℃，处理3hr2 s6 d5 y( T( k% B8 I
2．3hr后，弃去培养液，用胰酶将ES克隆消化成单细胞: p; Z' `# q- f
3．离心：1200rpm，5min
I6 u, |0 Y. M c% m" x4．弃上清，留大约500ul液体重悬细胞) K7 p+ q6 W9 o" w! f
5．一滴一滴慢慢加入10ml37℃预热30min的KCl溶液（配方见下），在37℃下低渗30min
# k5 t2 N* v5 {6 A6．加入2ml固定液（配方见下）
* F/ M4 t* Y# Z# q! {: Z' o7．离心：1200rpm，5min9 f# _" W& g/ r! @
8．弃上清，留大约500ul液体轻轻重悬细胞后，加入10ml固定液，室温固定10min Q* U3 S7 z( [+ m$ Q
9．离心：1200rpm，5min
9 l+ g* g6 n6 t, _/ S5 c10．再重复步骤8，9两次
& Q: ]9 X; T2 e. z" Z' H11．弃上清，剩余适量固定液（大约200ul），轻轻吹匀细胞悬液后，滴片; `6 J5 ~, y5 o& w( i, _4 Q( s
12．室温老化两天
5 f" D( e7 @( T( T13．65℃，4hr（注意要让温度自然降下来）* N" ^$ r E' F
14．0.1%胰酶溶液（用生理盐水配，4℃保存）消化带型
8 e! `) ~5 i# F* `15．37℃水浴消化（时间需要自己掌握30s，45s或者1min都有可能）
5 h/ l. C v6 n8 A' `2 c0 B16．Gimas染液染色5min，镜检. `: [* i; m1 u- ~
/ i7 H! j c) x- D( c9 l1 d低渗液KCl溶液配方：
N2 B8 f. t( {0 L0.16gKCl+0.125g枸橼酸钠溶入50mlmilliq水中 p7 u7 C# y7 ^# X: A
% m* a: _1 G2 X: g5 o固定液配方：冰醋酸：甲醇＝1：3
* ~% G$ i9 Q/ c
& s; K0 x- h: @滴片用的是冰片：玻璃片用95％酒精浸泡过夜（去掉表面的油脂），在-20℃保存，滴片时从-20℃拿出，尽快滴上。 |
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发表于 2010-6-2 12:05
发表于 2010-6-2 16:45
