请教：oct4、nanog免疫荧光染色

friendly0722

最近小妹做J1的免疫荧光，但是不知为什么oct4和nanog总是做不出结果，打孔的浓度和时间都摸索过，抗体的浓度也摸索过，就是不知道问题出在哪里。现在看荧光时候饲养层也会染上，集落也能染上，但是很弱很弱，几乎可以说没有，我应该怎么做呢？

maxiaorongqp

有图不，或具体操作细节

饶冠华

呵呵 我前段时间刚摸索过细胞核蛋白染色的方法，你很幸运哈。' G# Z; T2 h* A4 r6 q$ b* z
我的方法步骤是：0 R$ `5 S- g/ E3 g7 i
1。用丙酮：无水乙醇=1：1的混合液-20°C 固定20~30分钟。2 W7 W" P1 W# S! a1 e( @
2。吸干固定液，室温干燥15分钟  c  h1 y7 L" f  U
3。PBS复水15分钟1 W* l* W$ o+ g  O
4。2N盐酸室温10分钟，然后换成1N的盐酸10分钟。
/ N$ c: r5 D8 N6 ~6 k5。PBS 清洗3*10分钟5 f/ l  l0 G7 r3 Z
6。PBS+1%BSA或者山羊血清30分钟& y; _+ _7 a5 C. e
7。封闭液稀释抗体，一抗4°C过夜5 i, A8 N# b2 _0 p
8。PBS洗3*10分钟! d% Y5 k" Y- I
9。二抗室温1~2小时8 i! r# V$ h3 j6 v$ I3 \) ^" H
10。PBS洗  然后DAPI染核 封片4 a* l+ ~, C% ?0 l( h
如果这个方法做不出来就再找我吧

qingyueqingfeng

我也在做同样的检测，同样没有荧光，今天用了最大浓度的一抗，没有设置其他浓度，明天看看有没有结果，有了和你分享，没有共同努力。+ \2 `/ @( |/ X; s- d7 Y. Q" u2 I- F
我做PCR 是有结果的，你也可以先跑一下

饶冠华

回复 4# qingyueqingfeng , N" N$ b+ S# ~: h8 ?

8 ~" C% e. J. b( r. Z- [+ {8 I* W呵呵 跟一抗浓度没什么关系的 个人感觉  而且按照文献上的方法基本上很难染出来  我都试过了  上面那种方法是我试过最好用的 而且染色效果最好  
- B1 z  h6 {- y- `1 n现在电脑里没有照片 等下次copy下来之后再发一张染色效果给你们看吧

上海过客

请问饶斑竹 ，你提供的方法 ，1-9步还可以理解 。第10 步为什么要做呢？
3 I3 o* D: l+ E+ H2 B! L6 K" Q9 V" \# @7 A0 o, q4 c9 @+ z
不是太明白 。

qizhi502

回复 6# 上海过客
" G3 @" K& C, K: L+ `% S2 r3 ~4 h% j/ s
- R# u" C: P+ t4 U6 g
    pbs洗去非特异结合的二抗，然后染核

stemcell8

请问你的抗体在哪买的？多钱啊

farmer

学习一下。谢谢！

饶冠华

3 f8 |7 Q2 p" T5 @% j3 x3 d
; w3 s- ~. i1 T# d% s* g$ `" ^
回复 5# 饶冠华
2 C3 y0 v3 B0 L0 R, }这张是oct4的染色效果  不过HCl处理时间有点长，导致核蛋白显得有些弥散
& m. E8 `% c! o1 J  o- C& `2 F