请教：oct4、nanog免疫荧光染色

friendly0722

最近小妹做J1的免疫荧光，但是不知为什么oct4和nanog总是做不出结果，打孔的浓度和时间都摸索过，抗体的浓度也摸索过，就是不知道问题出在哪里。现在看荧光时候饲养层也会染上，集落也能染上，但是很弱很弱，几乎可以说没有，我应该怎么做呢？

maxiaorongqp

有图不，或具体操作细节

饶冠华

呵呵 我前段时间刚摸索过细胞核蛋白染色的方法，你很幸运哈。8 x8 \2 o0 @  b7 d2 b
我的方法步骤是：
/ I" x- K4 r0 N) B1。用丙酮：无水乙醇=1：1的混合液-20°C 固定20~30分钟。$ [, \5 Y5 x2 e& P5 B
2。吸干固定液，室温干燥15分钟
9 Z5 A1 c5 }  D+ V1 I! W3。PBS复水15分钟1 f  Y! ?  u3 @: G
4。2N盐酸室温10分钟，然后换成1N的盐酸10分钟。
: s0 M. z/ P% k5。PBS 清洗3*10分钟
/ Z! {8 c% s, [% j6。PBS+1%BSA或者山羊血清30分钟
* z4 r. O2 B$ }" c) [- f  }7。封闭液稀释抗体，一抗4°C过夜2 x' F! e7 g4 d
8。PBS洗3*10分钟! k2 o+ ^4 B) v, w/ ?/ w
9。二抗室温1~2小时$ O# j! d/ p' K
10。PBS洗  然后DAPI染核 封片
1 I' q! X2 S+ }1 X( b如果这个方法做不出来就再找我吧

qingyueqingfeng

我也在做同样的检测，同样没有荧光，今天用了最大浓度的一抗，没有设置其他浓度，明天看看有没有结果，有了和你分享，没有共同努力。
# k) O% R2 `, D% k  L1 t  A我做PCR 是有结果的，你也可以先跑一下

饶冠华

回复 4# qingyueqingfeng
' _- D: {+ o, _1 m# c. p; F, D+ k, ^: Q* X* V$ g, i
呵呵 跟一抗浓度没什么关系的 个人感觉  而且按照文献上的方法基本上很难染出来  我都试过了  上面那种方法是我试过最好用的 而且染色效果最好  , w  F, c7 y% X( b# \& i
现在电脑里没有照片 等下次copy下来之后再发一张染色效果给你们看吧

上海过客

请问饶斑竹 ，你提供的方法 ，1-9步还可以理解 。第10 步为什么要做呢？$ H+ m0 h9 [$ d/ z+ H9 l3 t
" j( @0 j: [0 s
不是太明白 。

qizhi502

回复 6# 上海过客 , o: O8 t+ X1 {  [
" a! a2 p' ^  R* H* |

* t5 R9 l) w' u$ r9 |" e    pbs洗去非特异结合的二抗，然后染核

stemcell8

请问你的抗体在哪买的？多钱啊

farmer

学习一下。谢谢！

饶冠华

+ u$ j5 M# {  K( u4 c
( H' p1 T, v9 l* R4 j
回复 5# 饶冠华 : l% n; d. |" o! e' W
这张是oct4的染色效果  不过HCl处理时间有点长，导致核蛋白显得有些弥散
3 ?/ w% N3 J- u) j( C
9 D+ ~/ ]( D& v: X