请教：oct4、nanog免疫荧光染色

lujn100

抗体稀释液会不会有问题，可以试下PBST溶BSA，这样洗的时候也要用PBST，另外，一抗过夜后最好在室温下再孵育一段时间，我用这个方法效果好一些，ICC的问题确实比较麻烦，慢慢找原因吧~

zsc78

今天遇到相同的困惑

zsc78

我用的是Santa的一抗，二抗是Invitrogen的。也是没有染出来。实验步骤如下：# R& S* [, q! H2 S9 _
* Y) v9 o+ O* D: E% `
1.        取出细胞爬片放到24孔或12孔培养板内，PBS漂洗3次；
  t3 k* @/ q; E0 j7 Q3 b. N2.        用4％冷的多聚甲醛固定20min，PBS漂洗3次；
7 Z5 W6 Z  R6 i$ ^! \; T9 ^- `; m3.        0.1％Triton X－100通透30min，PBS漂洗3次；. B% z( B( }. B4 m% D8 z
4.        与10%二抗相同宿主的血清封闭30min，吸弃液体；
2 ]* K, U' Z1 R' K8 F) A5.        一抗4℃ 湿盒内过夜，PBS漂洗3次；
" f1 z% i. z) W* Y* v* c6 ]6.        二抗37℃孵育45min，PBS漂洗3次；9 z% G0 i; ~2 w; F9 K
7.        最好用DAPI染核，37℃染10min；; }  |% s5 Y! X7 p4 z
8.        蒸馏水洗掉PBS，甘油封片
# b& F* F) W' X; F
2 H, l5 B- m- s* e. D请帮忙找找原因。按照饶版主的方法试一试。

shewawa

1.wash the cells carefully by PBS and fixed with 4% paraformaldehyde for 20 min at RT. PBS wash twice." p; A. s5 V. o$ @2 A; @2 B
2.blocking with 1% BSA 1 hour and 0.1% Triton X for 5 min. also need to wash by PBS.
0 L8 l, W, N9 }+ ?3Staining was carried out using anti-Oct3/4 antibody (Santa Cruz Biotechnology) overnight at 4°C. (1:200): Z5 _. Q$ k( T, I( Q! D6 _
4. After washing, proper secondary antibodies were applied for 1 hour at RT0 o+ F5 D  k( H1 O$ i  E0 l
5. nuclei were counterstained with DAPI for 5 min. ' _. |# }6 L3 V
6. PBS wash.
0 e! T: ~/ K8 s, V$ m7. moutain by moutain medium. % W! \- j9 p. L$ |) _8 S
8. Using the glass cover to cover it and seal the slide with nail polish./ P6 W2 W$ S& S+ y; U1 E$ w
9. go to microscope!
9 E( ~1 v) V: S, j! g  a1 O实验protocol里面的试剂我不知道用汉语怎么翻译，就用英语写了。
; m/ k' }: s/ _# Y0 m具体的immunocytochemistry方法你可以看抗体的使用说明书，我记得KLF4后面有很详细的protocol，我就是按照那个做的。

shewawa

回复 10# 饶冠华
6 X0 v8 G) F. B/ i) X+ F* r4 W/ R+ l3 I% m( Q7 F# O

9 k2 I& X% z1 {$ |- z    这张图看起来好像是second-antibody浓度不够。要不就是microscope拍摄效果问题，建议用下kyenence,这个机器很好用，操作简单，速度超快，个人比较喜欢。

饶冠华

回复 15# shewawa
7 z* K, p( E/ E2 r6 Q3 i
' M/ j$ O8 ~- r; A0 R* ^% e2 S呵呵  谢谢你的建议 ，我这个是在confocal 下照的  这次是没有做好  我师姐做的核染那是非常非常漂亮   可惜我技术还没有到那个境界

myrudy

mark

sniper

二抗的孵育时间可以适当延长一点

sheepthief

回复 饶冠华 的帖子
% z" E$ s0 R2 f  y$ Y2 _+ \1 j# R+ j7 `
饶版主，你好，关于ES的免疫荧光我有两个小问题：一是细胞培养的问题，是在六孔板内放上盖玻片来养吗？让细胞长在盖玻片上再做？二是我在文献上看到有人是将细胞生长在明胶包被的chamber slides，不知道是什么东西？一定要用这个吗?非常感谢，盼望回复。

cony

谁有NANOG，SSEA1抗体？愿以OCT4 ，SOX2等量互换，谢谢