原代细胞冻存技术

aehxing

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原代细胞冻存技术
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0 ~" b; P( n2 S4 `4 S3 a9 ~这觉得这个归纳的还比较简单。是从一个网上站上看到的，里面还有其他相关技术。8 u  [. V6 v( M2 i1 J  T  v
1、选用生长情况好，数量较多的原代细胞，冻存前一天换液一次。0 z8 B0 A% Y9 B' Z3 D" z0 }0 c
2、贴壁细胞需用0.25％胰酶常规消化将细胞消化下来，将细胞悬液收集至离心管中。2 w. m! L$ X( A, Q
3、1000rpm离心5分钟，弃上清液。
- ^% R) ~6 \1 R+ C+ j, f4、沉淀加含DMSO的培养液，计数，调整至（1-10）×106/ml。* K0 W. O% s0 i) a+ k; d9 H
5、将悬液分至冻存管中，每管1 ml。
4 D, P  z' c7 k7 w1 ]( C5 o6、密封冻存管，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。
. s1 i$ {4 a4 g1 Y  e/ n7、用记号笔标明细胞种类，冻存日期。
1 c8 X+ U2 a  }! ?: T/ L1 v8、按下列顺序降温：室温→4℃（20分钟〕→冰箱冷冻室（30分钟）→超低温冰箱（－80℃过夜）→液氮。

qzx_everything

谢谢啦

show0ji3

个人认为，最好别用内旋的，容易爆瓶，另一个容易在解冻的时候污染。

277951986

我们实验室都是用DMSO:血清：培养基=2:1:7，混匀后，直接用棉花包住，再装进一次性手套的手指里面，直接放-80度，过夜后就可放入液氮内。比从4度到-20度再到-80度冻的细胞活性药好很多。

afei198520

DMSO只要控制在一定浓度以下就不会对细胞造成损伤了。1 G2 b/ a2 @8 @. m4 @
冻存管爆裂的事情我们实验室还真的从来没有发生过呢。

morning860

回复 14# deron
& d" n5 [' y2 c0 ~. ]# e0 M# D( `4 z/ Z6 K- Y" [( m

4 y: {  u  K7 [8 p+ j( q    成活率等到时我复苏的时候就知道了，至于加的顺序以前真没在意，但我特意看了下冻存管里液体的颜色，我记得是正常的，希望不要杯具了。。。

deron

回复 13# morning860
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6 G4 h8 q9 E4 q4 @& B% l    据说DMSO在十几度的时候对细胞的毒作用很大，不过我们没有试过成活率。猜测影响会有一些，但不大。$ A4 U7 |2 y& u5 T/ a; M
   记得是先加入血清，再加入DMSO即可。我经历过一次把血清往DMSO中加，结果整管液体立马变成棕灰色——我想是血清中的蛋白热变性了

morning860

回复 12# deron 2 A+ m! h! C7 c( Q
* ?6 `4 }) W6 A- n

% f7 `! A. x8 y, J& e, D+ ]% H    我们做的时候是把DMSO与血清1：4加到每个冻存管，然后再加等份的培养基细胞悬浮液，每个冻存管里加的液体总体积为1ml，体积比较少散热应该快些，但是也是在室温下操作的。。。不知道会不会有影响，刚冻了不久。。

deron

回复 11# morning860
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" g, J3 g9 Z* V3 T$ n3 Q    即使用程控降温仪，初始温度也不应高于10摄氏度。DMSO在常温下对细胞活性影响很大。而稀释DMSO的步骤本身就是一个大量放热的过程，所以建议先配好冻存液，4摄氏度保存。现用现加

morning860

回复 10# deron
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# F& l6 g. x3 w    如果不像你们一样对培养液进行预冷，而只是等所有的成分都加到一起后按温度梯度降温，那么是否加入DMSO和培养基血清的顺序就不用那么在意了呢？