原代细胞冻存技术

aehxing

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, B% E/ s' q( q' R& ?% J原代细胞冻存技术, ^6 z; N# s; O9 A* a- I

) J% k2 k$ L% g: K! ^这觉得这个归纳的还比较简单。是从一个网上站上看到的，里面还有其他相关技术。
" D; l1 \, P8 l5 |# ~1、选用生长情况好，数量较多的原代细胞，冻存前一天换液一次。% D" d/ v7 s9 k  f$ r% ]1 ]: }
2、贴壁细胞需用0.25％胰酶常规消化将细胞消化下来，将细胞悬液收集至离心管中。/ Z) q2 r8 `# y/ g, V( w# ~
3、1000rpm离心5分钟，弃上清液。
1 R) e% P' l8 L2 A6 v% @- L3 T' p1 c; J4、沉淀加含DMSO的培养液，计数，调整至（1-10）×106/ml。
: E! r. g. e9 u- Q% U/ v  Q5、将悬液分至冻存管中，每管1 ml。
0 H: e! ~. l+ y& K+ U% b8 j  H) L6、密封冻存管，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。
9 k- M+ y3 F8 ~$ l0 e& F7、用记号笔标明细胞种类，冻存日期。
  D; O) `5 c2 z; ~$ ]8、按下列顺序降温：室温→4℃（20分钟〕→冰箱冷冻室（30分钟）→超低温冰箱（－80℃过夜）→液氮。

bigbiggirl

最好用冻存盒，我们实验室有，加上异丙醇，就直接放-80度就可以了，说是保证每分钟降一度。是个好东西

morning860

但是书上也有说封口不能太紧，否则也很容易爆裂的~~

youyou0795

怎么看起来和普通的细胞株冻存技术一样？ 我们冻存细胞买的Corning的冻存管，质量很好，从来没有爆裂的情况

deron

推荐一种更加简单省时的冻存方法——不知道大家有没有试过直接加入4℃预冷过的冻存液混匀细胞，然后迅速冻到-80℃。节约很多时间，冻存液是由10%DMSO加90%含血清培养基配制而成，如细胞珍贵可适量增加血清含量。复苏时用台盼蓝染色检验，成活率在95%以上。

ouyi2738

回复 5# deron * R' V5 v& c' `
这个真没试过，有意思，回去试一下。我们冻存盒都被占了的时候，就直接包棉花，裹上一层棉花，直接扔-80里。好的管还是拧紧一点吧，液氮近不去，当然不会爆。另外我觉得Corning反倒是爱爆的，我们实验室订的外旋的Corning我都不用，自己订的cellstar的这个管是从来没爆过

deron

回复 6# ouyi2738
( Q9 C6 Y! W& J) @, S6 U$ O$ N7 A我们的Corning从来没爆过，内外旋的都挺好用。至于没冻存盒了，解决办法很多的，我们通常用血清瓶子，培养基瓶子等等等等直接把管子扔进去。如果放液氮的话我们会用纱布棉线打个中药包造型然后吊进罐子。

tuzi8780238

我觉得有个办法挺好的，就是用棉花将要冻存的严严实实的包裹起来，然后直接放进-80度过夜，再转入液氮，这舍了一步步降温麻烦了（我们实验室一师兄发明的，屡试不爽）。

dilal

国外有些知名的干细胞研究所推荐的干细胞培养指南中提到：在加冻存液时需要一滴滴加入，以防止细胞受损，但我看我们实验室的都是直接加入的。冻存液的加入方式对细胞生长真的有影响吗？

deron

回复 9# dilal , X" o) H  J% b
+ s. b4 O& ^( H

$ b$ W- T4 ]+ T    我们都是直接加的，没有影响，也许某些特殊的细胞需要特殊的处理吧，不知道他们这么做的原理是什么呢？) M, ^- F. W1 M. F6 W1 w; X, w
   另外，我们配制10%DMSO的时候倒是需要把DMSO一点点加入预冷的培养液中，而不能反之——正如稀释浓硫酸的时候只能将浓硫酸一点点加入水中一样，因为这两个稀释过程都能大量产热。