原代细胞冻存技术

aehxing

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5 D$ l! Y/ A4 z, T! F( T+ n原代细胞冻存技术
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* p( A7 L# Y" {5 P这觉得这个归纳的还比较简单。是从一个网上站上看到的，里面还有其他相关技术。
8 @" O5 e& Y% W) G3 E. Y- F1、选用生长情况好，数量较多的原代细胞，冻存前一天换液一次。
( }0 o" f" Q. _7 l3 C) Q2、贴壁细胞需用0.25％胰酶常规消化将细胞消化下来，将细胞悬液收集至离心管中。* A: Z" `6 g3 ~1 ]+ \/ j/ q5 i2 C1 t, H
3、1000rpm离心5分钟，弃上清液。2 v3 i6 W# \( E. M, w1 B9 Z
4、沉淀加含DMSO的培养液，计数，调整至（1-10）×106/ml。
& l/ u( h' {- Y& M/ O1 d4 K! Q, F5、将悬液分至冻存管中，每管1 ml。
; @% P& x6 z/ D( Q6、密封冻存管，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。
% Y; ^# [- c; r3 i2 [7、用记号笔标明细胞种类，冻存日期。, E" V% p; {" d- H4 P
8、按下列顺序降温：室温→4℃（20分钟〕→冰箱冷冻室（30分钟）→超低温冰箱（－80℃过夜）→液氮。

qzx_everything

谢谢啦

show0ji3

个人认为，最好别用内旋的，容易爆瓶，另一个容易在解冻的时候污染。

277951986

我们实验室都是用DMSO:血清：培养基=2:1:7，混匀后，直接用棉花包住，再装进一次性手套的手指里面，直接放-80度，过夜后就可放入液氮内。比从4度到-20度再到-80度冻的细胞活性药好很多。

afei198520

DMSO只要控制在一定浓度以下就不会对细胞造成损伤了。7 c& m% w% J; N! q3 C9 J: t- j$ T
冻存管爆裂的事情我们实验室还真的从来没有发生过呢。

morning860

回复 14# deron
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- O( R  a) @! O( f- I! B
! Z2 i% c/ i" i/ m9 `9 M- h" B    成活率等到时我复苏的时候就知道了，至于加的顺序以前真没在意，但我特意看了下冻存管里液体的颜色，我记得是正常的，希望不要杯具了。。。

deron

回复 13# morning860 ; f$ ^/ Q& k" \1 f3 G
  ]. ]! i$ Y; K( q0 A9 H

8 v; U2 ?0 |; g$ J& K& {7 ?    据说DMSO在十几度的时候对细胞的毒作用很大，不过我们没有试过成活率。猜测影响会有一些，但不大。7 ?9 n% g) b1 D' |0 A4 X
   记得是先加入血清，再加入DMSO即可。我经历过一次把血清往DMSO中加，结果整管液体立马变成棕灰色——我想是血清中的蛋白热变性了

morning860

回复 12# deron 6 o% s1 H9 O+ g* s+ D
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    我们做的时候是把DMSO与血清1：4加到每个冻存管，然后再加等份的培养基细胞悬浮液，每个冻存管里加的液体总体积为1ml，体积比较少散热应该快些，但是也是在室温下操作的。。。不知道会不会有影响，刚冻了不久。。

deron

回复 11# morning860
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2 E/ ]) |* P/ h% y    即使用程控降温仪，初始温度也不应高于10摄氏度。DMSO在常温下对细胞活性影响很大。而稀释DMSO的步骤本身就是一个大量放热的过程，所以建议先配好冻存液，4摄氏度保存。现用现加

morning860

回复 10# deron 9 d! o2 y' e; j5 E5 U- H' h

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/ l  O0 [( _5 R1 u# W    如果不像你们一样对培养液进行预冷，而只是等所有的成分都加到一起后按温度梯度降温，那么是否加入DMSO和培养基血清的顺序就不用那么在意了呢？