请教有关real-time PCR批次间差异过大的问题

zhmgeneral

请教各位老师一个有关real-time PCR的问题1 |1 {' L3 ~& ?% i: X
+ ^& S! z) y6 q4 a7 z6 w- u
我做了几个月的real-time PCR了# z$ i1 {" W) X6 ]7 I7 F
& w, i# p& c0 U- D' t: O# A* h
发现批次间结果差异很大
5 O8 s7 z2 w" _2 o$ _9 Q: w* E. `* H0 h* {3 `
虽然趋势都是一样的，可是每次CT值差异很大- E/ V6 h5 A& h1 E; m

4 r/ o& Q+ K4 q9 [1 U( {比如说我有4个组，可能某一次扩出来后，四个组的某基因表达比例为1：3：5：7
) Z% X! [3 N( d
7 y2 _8 X9 d- h$ [下一次再做，可能就变成1：5：9：13了。。。。- ?  x) w4 L  \% V7 w3 n. c

! e0 R* V3 D/ j, `- D5 Z虽然说递增是对的、也是理想状态，可是这增加的幅度也太大了点吧。。。; c  b4 H7 V, x; g
" k  `1 `0 v2 v& [/ H
而且批次间增加的幅度都不一样！1 |3 c6 @) W2 b; w8 ~3 t' m

+ k/ P; E8 Z9 f% W是不是跟细胞有关系呢？% g1 H5 D3 Z- v4 _4 D) z, G
& J" g/ @) c! c6 {
我每次做Real time用的细胞都是原代细胞，会不会是细胞的批次间差异导致的呢？
8 _. }1 n! x+ o) U
( r" S: p, l, h0 W$ z非常郁闷，希望各位老师能给予点拨哈
- u  {* F/ z. Q) J! d- L2 k& U4 R% {& e! k6 X5 c
小弟在此先行谢过！

zhmgeneral

顶起，继续求助~·

上海过客

做三次 以上统计 ，单次，单次  的比 没有任何意义 。
& [. @6 m) P5 M0 Y5 N7 Q+ M8 V. m6 g/ @
只有统计了才有意义

hndxws

不同批次细胞状态的确是不一样的，RT-PCR一般是相对定量，所以内参显得非常重要。看你举例的数据之间的差异都是一样的，只不过一组是2，一组是4。我估计这可能是在处理数据相对定量时内参发生理变化所致。估计你应该做了重复了，不同时间的实验结果肯定会有出入的，解决的办法就是如楼上所说，不确定的话就多重复几次，重复的结果才比较可信。

上海过客

做 real -time  没有统计图 等于没有做 。/ k) ?% o2 c- G1 u8 {6 ^+ s* R
! ?/ ^& s  O7 z! ~
我还没有开始做，但是现在看文献是 这样的 。

hljzyydx

不知道你注意过仪器温度没，我们也遇到过类似的情况，怀疑是环境温度过高，对仪器产生影响