请教有关real-time PCR批次间差异过大的问题

zhmgeneral

请教各位老师一个有关real-time PCR的问题
2 V, ^9 s* J1 ?2 N, Y  t
( q' w: ?. s3 D* u我做了几个月的real-time PCR了
1 I4 }) ~6 O7 X/ D
  W' l, Y7 v8 F0 s& d" L3 x7 n0 m) [发现批次间结果差异很大
+ j/ X6 f9 [2 E" R
& X8 k$ V1 Z  o$ a& m- U虽然趋势都是一样的，可是每次CT值差异很大
! P* B& H' H/ ?  u. ]9 g7 W" A  E3 a- B* t$ t" I
比如说我有4个组，可能某一次扩出来后，四个组的某基因表达比例为1：3：5：7
& \/ J6 ?; D5 t, V" J4 A/ r2 i, i; K! I
下一次再做，可能就变成1：5：9：13了。。。。7 d2 f$ W& G6 Y- }; u! K" u# F+ n  y, w
0 H6 Q" i( e1 a" x6 r7 N
虽然说递增是对的、也是理想状态，可是这增加的幅度也太大了点吧。。。5 Q! \! ?5 ~" ~, ?, b

9 a1 K9 C9 H' |7 u9 c7 y而且批次间增加的幅度都不一样！
. c5 r2 s+ J& s  f. B0 {+ o6 e0 U. x6 h& f% H: r5 A; M0 B3 j
是不是跟细胞有关系呢？
3 u2 G8 X) h2 N6 x) [5 n8 ~+ f% X8 v/ ]; ~1 k0 z2 d  R+ X
我每次做Real time用的细胞都是原代细胞，会不会是细胞的批次间差异导致的呢？" g1 q$ }& j  L0 Q" Z( P$ e
" k3 g- S: v" f" l: a& l
非常郁闷，希望各位老师能给予点拨哈
) m) v2 [1 ]/ ?4 l' a6 u" k: \) V+ s) k  g( f  c0 l/ R! j
小弟在此先行谢过！

zhmgeneral

顶起，继续求助~·

上海过客

做三次 以上统计 ，单次，单次  的比 没有任何意义 。
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5 d  ]) s+ G, h4 @6 z5 Z  M只有统计了才有意义

hndxws

不同批次细胞状态的确是不一样的，RT-PCR一般是相对定量，所以内参显得非常重要。看你举例的数据之间的差异都是一样的，只不过一组是2，一组是4。我估计这可能是在处理数据相对定量时内参发生理变化所致。估计你应该做了重复了，不同时间的实验结果肯定会有出入的，解决的办法就是如楼上所说，不确定的话就多重复几次，重复的结果才比较可信。

上海过客

做 real -time  没有统计图 等于没有做 。. V4 e- R7 |5 p# R. v+ N4 h9 r
2 p: _5 C, I; ^7 Q, _- J* d: ]8 o" h
我还没有开始做，但是现在看文献是 这样的 。

hljzyydx

不知道你注意过仪器温度没，我们也遇到过类似的情况，怀疑是环境温度过高，对仪器产生影响