Cell子刊：诺奖团队揭开CRISPR基因编辑效率之谜

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Cell子刊：诺奖团队揭开CRISPR基因编辑效率之谜% S/ y: d4 o9 L3 ^. O
来源：生物世界 2025-04-28 16:49
' Y# E4 X: n- Q0 v9 O7 j2 I这项研究颠覆了“PAM 越宽松越好”的传统认知，揭示特异性与效率的精准平衡才是关键。
: K* O% y8 J, N  T( p8 P; e& r' w! GCRISPR-Cas9 被誉为“基因魔剪”，但其编辑效率在不同场景下差异巨大。为何有些 Cas9 变体能高效编辑，而另一些却频频“失手”？8 B, _% j% ^  |4 L6 ?; P* X$ u
近日，Molecular Cell 期刊发表了最新研究揭示了背后的核心机，这项由诺奖得主 Jennifer Doudna 教授（博士后史弘略为论文第一作者）领衔的研究，究揭示了广泛 PAM 识别与基因组编辑效率之间的基本权衡，提出了高效的 RNA 引导的基因组编辑依赖于优化的两步靶标捕获过程，其中选择性但低亲和力的 PAM 结合优先于快速的 DNA 解旋。这不仅解开了 CRISPR-Cas9 基因编辑效率密码，还为设计更有效的 CRISPR-Cas 及相关 RNA 引导的基因组编辑器奠定了基础。9 \5 x2 r- ^" W8 R. A4 a
这些发现也为长期以来关于 CRISPR-Cas9 基因编辑“是否要牺牲效率换取广谱性”的争议画上了句号。
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Cas9 的“两步走”策略
$ g# C" \7 c9 u5 j8 C( I# U: c就像快递员通过邮编和门牌号精准投递，Cas9 通过两步精准定位 DNA 靶点：9 [6 H$ z; ^, g6 N
1、PAM识别：Cas9 首先识别目标 DNA 上的 PAM 序列（例如 NGG），锁定目标区域；$ H- D+ y2 [( m- m- J5 z) Y) S+ `
2、DNA解旋：随后解开 DNA 双螺旋，让 gRNA 与靶序列配对，形成 R-loop 结构并切割 DNA 双链。
- h( n! D7 l+ m关键发现：野生型 Cas9 与的 PAM 序列结合“快而松”——快速扫描大量非目标位点后迅速释放，一旦找到正确靶点则高效解旋。这种“点到即止”的策略，使其在复杂基因组中游刃有余。! Y7 j! C/ C& S2 P  ~- S! T. L
宽松版 Cas9 的“效率陷阱”4 _! i# C2 h8 _
为扩大 Cas9 可靶向编辑的范围，科学家开发了 Cas9 变体——SpRY，这种宽松版 Cas9（PAM-relaxed Cas9）可识别几乎任何 PAM 序列，但这类工具却存在严重缺陷：
) O6 X8 `5 I# k$ e4 ]) b9 w陷入“温柔陷阱”：SpRY 与非目标 DNA 结合更紧密，在错误位点反复停留，犹如陷入泥潭；1 ]! v% U  x1 x/ Q8 ]
解旋速度减慢：即使找到正确靶点，其解旋效率仅为野生型 Cas9 的1/3；
% Z' F9 Z, I6 J" `' A敌我不分：竞争实验显示，SpRY 在非目标 DNA 存在时效率暴跌 200 倍，而野生型几乎不受影响。+ T- ]: I; L* w  h
研究团队通过单分子追踪技术（AuRBT）首次捕捉到动态过程：SpRY 在靶点处反复尝试解旋却频频失败，而野生型 Cas9 则“一气呵成”。这种“卡壳”现象源于其过强的初始结合力，导致能量屏障升高。8 {8 X$ j1 k- k
设计新思路：平衡“搜索”与“剪切”
" F  y! {0 C" h7 \, A研究提出基因编辑器优化法则：
: y" g; }1 m: s  R0 e2 b% s5 n7 G2 _1、弱化非特异性结合：避免工具酶被“无效位点”困住；6 q. O& ?) G8 q4 u' W- v( ^
2、加速靶点解旋：通过设计突变，降低 DNA 解旋能量壁垒；+ B4 Z; A  y# s
3、两步协同优化：在 PAM 识别与解旋速度间寻找最佳平衡点。0 G  p: E4 f$ X$ a/ g/ z/ I
突破性验证：在靶点旁引入“DNA气泡”（削弱双螺旋稳定性），SpRY 效率瞬间恢复至野生型 Cas9 水平，印证了能量壁垒理论。
" x! Y- W* C0 q. V未来展望' T! b( x( g6 m9 T
这项研究颠覆了“PAM 越宽松越好”的传统认知，揭示特异性与效率的精准平衡才是关键。基于此，科学家可重新设计 Cas9 变体：+ W! }5 |$ f% |5 |' ]
开发“智能扫描”工具，在扩展靶点范围的同时保持高速搜索；- n( [5 s$ Z9 T- B, D
优化古细菌来源的IscB/TnpB等新型编辑器，突破现有技术瓶颈；
* [! L" H) T' v助力遗传病治疗、作物改良等应用，让基因编辑更安全高效。8 d$ P( O( O! V# W, I. p
研究团队表示，这项研究提示我们，不应该盲目追求去 PAM 化，未来基因编辑工具应构建一个多样化的“PAM工具箱”，为不同临床或科研需求选择合适的 Cas9 变体，而非妄图发出一个万能工具。. V  x8 J4 T7 U2 g5 _" h

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