Cell子刊：诺奖团队揭开CRISPR基因编辑效率之谜

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Cell子刊：诺奖团队揭开CRISPR基因编辑效率之谜# H/ w. r. m% C" J& l! B# m
来源：生物世界 2025-04-28 16:49& q( ^, P( r" Y! m9 h3 {$ {
这项研究颠覆了“PAM 越宽松越好”的传统认知，揭示特异性与效率的精准平衡才是关键。
  T3 {% w- H# G( dCRISPR-Cas9 被誉为“基因魔剪”，但其编辑效率在不同场景下差异巨大。为何有些 Cas9 变体能高效编辑，而另一些却频频“失手”？
1 |2 |2 d* K2 o近日，Molecular Cell 期刊发表了最新研究揭示了背后的核心机，这项由诺奖得主 Jennifer Doudna 教授（博士后史弘略为论文第一作者）领衔的研究，究揭示了广泛 PAM 识别与基因组编辑效率之间的基本权衡，提出了高效的 RNA 引导的基因组编辑依赖于优化的两步靶标捕获过程，其中选择性但低亲和力的 PAM 结合优先于快速的 DNA 解旋。这不仅解开了 CRISPR-Cas9 基因编辑效率密码，还为设计更有效的 CRISPR-Cas 及相关 RNA 引导的基因组编辑器奠定了基础。# b8 l4 N9 R) O. W
这些发现也为长期以来关于 CRISPR-Cas9 基因编辑“是否要牺牲效率换取广谱性”的争议画上了句号。3 y& Q8 X' P$ h" v; d* u

* A' e! K; O# B4 v4 HCas9 的“两步走”策略
1 ^! e$ P# M, X! C2 W7 J就像快递员通过邮编和门牌号精准投递，Cas9 通过两步精准定位 DNA 靶点：
5 W, _6 J0 P+ O4 H3 B3 y1、PAM识别：Cas9 首先识别目标 DNA 上的 PAM 序列（例如 NGG），锁定目标区域；
4 Y7 r3 y/ H# V0 b2、DNA解旋：随后解开 DNA 双螺旋，让 gRNA 与靶序列配对，形成 R-loop 结构并切割 DNA 双链。
1 K5 U  ?" q$ L关键发现：野生型 Cas9 与的 PAM 序列结合“快而松”——快速扫描大量非目标位点后迅速释放，一旦找到正确靶点则高效解旋。这种“点到即止”的策略，使其在复杂基因组中游刃有余。) V% m) W- a# r1 j% A
宽松版 Cas9 的“效率陷阱”. b# E+ L/ p2 Y
为扩大 Cas9 可靶向编辑的范围，科学家开发了 Cas9 变体——SpRY，这种宽松版 Cas9（PAM-relaxed Cas9）可识别几乎任何 PAM 序列，但这类工具却存在严重缺陷：: t5 F' F" B; H- H' T. n
陷入“温柔陷阱”：SpRY 与非目标 DNA 结合更紧密，在错误位点反复停留，犹如陷入泥潭；7 z# x  P% i1 g( A
解旋速度减慢：即使找到正确靶点，其解旋效率仅为野生型 Cas9 的1/3；
) f. Q9 S, U! `8 T& }$ r& X3 T敌我不分：竞争实验显示，SpRY 在非目标 DNA 存在时效率暴跌 200 倍，而野生型几乎不受影响。. I' H' M% {( N; h: A$ l0 |
研究团队通过单分子追踪技术（AuRBT）首次捕捉到动态过程：SpRY 在靶点处反复尝试解旋却频频失败，而野生型 Cas9 则“一气呵成”。这种“卡壳”现象源于其过强的初始结合力，导致能量屏障升高。6 y5 t0 P$ y& s6 \9 ]
设计新思路：平衡“搜索”与“剪切”. l7 A' D: V8 _* H% A2 D
研究提出基因编辑器优化法则：
. _2 ~3 G7 F1 `! u1、弱化非特异性结合：避免工具酶被“无效位点”困住；& Y' `3 ^& b' l( w4 R2 w
2、加速靶点解旋：通过设计突变，降低 DNA 解旋能量壁垒；
  s$ c* {/ ~8 o% @& P1 t# x3、两步协同优化：在 PAM 识别与解旋速度间寻找最佳平衡点。
2 y5 W! N/ G6 O, }突破性验证：在靶点旁引入“DNA气泡”（削弱双螺旋稳定性），SpRY 效率瞬间恢复至野生型 Cas9 水平，印证了能量壁垒理论。3 j1 d6 y- n# P6 t$ N
未来展望
/ @! _" o4 x! ^; Z! F  V这项研究颠覆了“PAM 越宽松越好”的传统认知，揭示特异性与效率的精准平衡才是关键。基于此，科学家可重新设计 Cas9 变体：1 r7 N# S4 @) [
开发“智能扫描”工具，在扩展靶点范围的同时保持高速搜索；
- R! R- ]' k* F% l优化古细菌来源的IscB/TnpB等新型编辑器，突破现有技术瓶颈；
* s5 k0 m8 F  Y. G3 x0 U* g助力遗传病治疗、作物改良等应用，让基因编辑更安全高效。
; w; g  [/ K0 {2 J研究团队表示，这项研究提示我们，不应该盲目追求去 PAM 化，未来基因编辑工具应构建一个多样化的“PAM工具箱”，为不同临床或科研需求选择合适的 Cas9 变体，而非妄图发出一个万能工具。& [8 T$ g$ E) H; x: D* Z1 S

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