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Primer is a significant component of the PCR system. Here, we defined a system, which is composed of a few of visible components(such as primer, template, dNTPs, MgSO4, TaqEnz etc.), time(denature, annealing and elongation) and temperature(the same to previous).Primer is one member of these visible part, a determinant element.
5 y U$ k" z. Q7 l- m
" d$ i9 i: L( ~2 Q Actually, primer is a strand of nucleotide, it served as a starting point of the synthesis of new DNA. The cDNA(complementary DNA) extended from the 3' end of he primer, in PCR system. It is designed by researchers, and there are several basic principles for primer designation!
: ?6 r" _8 z& t9 G" ^6 l# ?
* @" ]% F) Z0 H2 ?5 {4 _, A+ |
6 Y& v0 {5 K- }9 j6 R& H
- C4 y7 N5 Y# h% ?5 q Basic Principles: 8 i* v1 U* V% M
0 t$ y: \; H% y; w9 K1 {5 R1 `: U
15-30 bp& v4 W" z# H2 h1 G7 n# d
3’ end critical pairing rules1 X# p9 ~( a6 s! J, T9 h
5’ end should be modified5 ~' \6 `9 h/ S9 k9 B4 T
No hairpin!; F$ L3 z6 Q. Z
No self-pairing(forward & reverse)/ e5 _- r, _5 B! _$ S& @
Tm!
@" H8 {! C5 F) n. m& j- EA T G C is randomly distributed
& v+ U; b* u( k5 K( A' B" O( Z5 {owning specificity
. m9 n& X* p5 Y& P... ...3 \ Q0 t+ B- R2 ]7 m. i r
: m5 N0 j* u4 z2 W$ t* fAuxiliary Softwares for Primer Designing!
+ z* D4 n0 Z! D; ]+ C( c
D$ f! Y% e9 o% V, U There are some softwares designed for the molecular biologic researchers all over the world, such as Oligo 6 and Primer Premier 5.0" l& \( W# n" i8 @
" x& b) X9 v! w# n
# _2 G- U) r A$ S4 B4 u
$ G( h+ w! Y: \- o5 d( V6 L1 k
% O, x }8 D4 e$ \9 i
To be continued! 7 i& F. v% S. b, W- Z% H% P
. r5 p" m% _+ N# ?4 n
M3 D7 m, i+ o/ R+ z: t' | 引物是人工合成的两段寡核苷酸 PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。- r" p% Q# w5 N9 M, j
. g- o, ~0 Q. {* u 在PCR（聚合酶链式反应）技术中，已知一段目的基因的核苷酸序列，根据这一序列合成引物，利用PCR扩增技术，目的基因DNA受热变性后解链为单链，引物与单链X相应互补序列结合，然后在DNA聚合酶作用下进行延伸，如此重复循环，延伸后得到的产物同样可以和引物结合。
, |9 Y! W4 J! z$ W5 W1 ~. i) y; Y! G* i2 n3 H& `
引物设计原则：4 \, f- a4 x- s! p5 ~
1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计
1 O% C4 Q3 N- `2.引物长度一般在15~30碱基之间9 u& [; V+ ]/ R2 ]
3.引物GC含量在40%~60%间，Tm值最好近72℃7 `+ ^9 W" [# R2 y' D% G2 p
4.引物3′端要避开密码子的第3位
( W1 _+ }2 V# ~5.引物3′端不能选择A，最好选择T
2 V; ]1 G! ?' _( y" F8 u6. 碱基要随机分布
D# ~% m; l3 G( I4 m; O! O7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列. F2 h4 m( Y0 L" P' V. G
8. 5′ 端和中间△G值应相对较高3′ 端较低
" \! V3 F- x) F9 ~4 {% o& b9.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰$ ~8 v$ A. m$ Y- R( c0 ^5 a
10. 扩增产物的单链不能形成二级结构4 ^7 G7 M2 M% e( X7 J! G4 \
11. 引物应具有特异性。 |
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发表于 2010-7-7 23:36
发表于 2010-7-8 09:24
发表于 2010-7-11 14:31
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