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急!原代培养,细胞消化打散后碎片太多!   [复制链接]

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包包
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楼主
发表于 2010-7-9 11:10 |只看该作者 |倒序浏览 |打印
急!急!急!我是做成体神经干细胞培养的新手,取的是10周小鼠的SVZ组织,第一次做细胞培养时细胞消化打散的还凑合,但是后来做了几批都是细胞碎片超多,用的是0.25%胰酶消化30min,每隔10min打散5-10次。离心1000rpm,3min.刚开始用的是无血清培养基终止消化,后来用的是加了血清的培养基终止消化,后来又换用玻璃吸管打散,手法尽可能的轻,但还是有很多碎片。
8 P$ z7 Q5 \( f0 Q
% W$ F! ]  l9 ~" i9 K4 Q0 C请各路高手给予指点,不胜感激!
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沙发
发表于 2010-7-9 11:54 |只看该作者
神经干细胞本来就很脆弱,估计是酶消化过头了。还有,我们都是直接用血清来终止消化,而不是带血清的培养基~
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藤椅
发表于 2010-7-9 11:55 |只看该作者
调整一下胰酶浓度和消化时间吧。如果你的手法已经尽可能的轻,就是胰酶的事儿了。
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板凳
发表于 2010-7-9 11:55 |只看该作者
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我不太了解神经干细胞,0.25%胰酶,你的消化要30分钟???求解
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报纸
发表于 2010-7-9 12:39 |只看该作者
建议换成0.125%或胶原酶,胰酶消化10-15min是足够的了  r/ X5 _, J8 e
" b! l$ ?% o9 f6 o1 x& \# j$ A
含10% 血清培养基科加到5倍胰酶体积来终止消化
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地板
发表于 2010-7-9 12:45 |只看该作者
胰酶浓度太高,我们一般用0.025%,时间就10分钟,你消化过了应该是
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发表于 2010-7-9 13:26 |只看该作者
楼主可以考虑将你的0.25%胰酶进行稀释,然后再使用。可以考虑稀释成0.125%。另外,消化时间不要太长,免得死太多的细胞。
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优秀会员 帅哥研究员

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发表于 2010-7-9 13:49 |只看该作者
可以稀释酶浓度之后再试试,30分钟似乎时间有点长,稍微的调整一下酶解的时间,楼主的细胞碎片很多肯定是消化不好的原因,时间偏长,而且还有离心,细胞经受不住啦
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发表于 2010-7-14 16:05 |只看该作者
谢谢!非常感谢朋友们的关注和回复!
( l* a2 Y' {0 z: e我最近还做了一批胎鼠的脑神经干细胞培养,培养的效果很好,消化:0.25%trypsin,15min,离心1000rpm,3min.现已出现了大量神经球,状态很好,基本没有碎片。这应该可以排除我试剂的问题。应该还是组织特异性的原因. 申明一下,我做的是10周小鼠的SVZ干细胞培养。
0 u1 }  F- Q. _' U% J
8 M1 b8 O& B8 X3 v: i" D从理论上讲,10周的小鼠比胎鼠的组织更难消化,所以胰酶的消化时间应该长一些。而且,我也尝试了缩短胰酶消化时间,减少吹打次数,但是还是以失败而告终。而且我查了很多文献,发现各个文献的差异都比较大,这让我很费解。我的感触是,细胞培养没有金标准。  I" G, G1 `5 }% c$ D( r
# O+ r" }: U4 P, C
现在,我准备换用TrypLE消化液(invitrogen的一种trypsin替代液)试用一下。我会向大家汇报结果的。
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发表于 2010-7-14 16:08 |只看该作者
在问大家一个小小的问题,你们打散细胞都用什么东东?
$ n5 M; J7 z! A
5 P& H+ P( v% A% i. l我们这边大家普遍用进口的1ml枪头。
1 ~9 O* O. E' p9 @; _! G" A如果用玻璃吸管的话,多大为宜?
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