急！原代培养，细胞消化打散后碎片太多！

SVZ

急！急！急！我是做成体神经干细胞培养的新手，取的是10周小鼠的SVZ组织，第一次做细胞培养时细胞消化打散的还凑合，但是后来做了几批都是细胞碎片超多，用的是0.25%胰酶消化30min，每隔10min打散5-10次。离心1000rpm，3min.刚开始用的是无血清培养基终止消化，后来用的是加了血清的培养基终止消化，后来又换用玻璃吸管打散，手法尽可能的轻，但还是有很多碎片。
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请各路高手给予指点，不胜感激！

zhmgeneral

神经干细胞本来就很脆弱，估计是酶消化过头了。还有，我们都是直接用血清来终止消化，而不是带血清的培养基~

sxjcsq2010

调整一下胰酶浓度和消化时间吧。如果你的手法已经尽可能的轻，就是胰酶的事儿了。

是鸟就要去飞

我不太了解神经干细胞，0.25%胰酶，你的消化要30分钟？？？求解

norther817

建议换成0.125%或胶原酶，胰酶消化10-15min是足够的了( O$ q' m: w, U4 C* @' U
/ i: }) |9 J! e5 H( p
含10% 血清培养基科加到5倍胰酶体积来终止消化

圆圆850

胰酶浓度太高，我们一般用0.025%，时间就10分钟，你消化过了应该是

双刀

楼主可以考虑将你的0.25%胰酶进行稀释，然后再使用。可以考虑稀释成0.125%。另外，消化时间不要太长，免得死太多的细胞。

afei198520

可以稀释酶浓度之后再试试，30分钟似乎时间有点长，稍微的调整一下酶解的时间，楼主的细胞碎片很多肯定是消化不好的原因，时间偏长，而且还有离心，细胞经受不住啦

SVZ

谢谢！非常感谢朋友们的关注和回复！
  s* z, X6 a7 C* n/ E2 H2 q  w我最近还做了一批胎鼠的脑神经干细胞培养，培养的效果很好，消化：0.25%trypsin，15min，离心1000rpm，3min.现已出现了大量神经球，状态很好，基本没有碎片。这应该可以排除我试剂的问题。应该还是组织特异性的原因. 申明一下，我做的是10周小鼠的SVZ干细胞培养。1 A( ^: T4 B4 g$ p7 V$ a$ @: @

$ g, H7 j" W0 ~/ p5 W' ]/ ~从理论上讲，10周的小鼠比胎鼠的组织更难消化，所以胰酶的消化时间应该长一些。而且，我也尝试了缩短胰酶消化时间，减少吹打次数，但是还是以失败而告终。而且我查了很多文献，发现各个文献的差异都比较大，这让我很费解。我的感触是，细胞培养没有金标准。1 \" J' N9 Z: C: t6 a( b+ Z

8 v4 Z$ |1 L% d现在，我准备换用TrypLE消化液（invitrogen的一种trypsin替代液）试用一下。我会向大家汇报结果的。

SVZ

在问大家一个小小的问题，你们打散细胞都用什么东东？6 x: F- K! @" y; p% U

. j0 W3 ~4 R# r3 X1 O! f) c! y我们这边大家普遍用进口的1ml枪头。6 P: Y4 `" L8 H# V' b2 i
如果用玻璃吸管的话，多大为宜？