mES制备EB照片

yaoyaoyatou

大家好！第一次制备EB，感觉很失败，不知道原因在哪里？希望大家能给我指点一下。
% W$ Y% _: P9 ]+ y' K# S% O! z我的EB培养基是：KO-DMEM, FBS,L-glu, NEAA, Pen-strep,meraptoethanol., t3 _: L0 K1 \# ?; c
mES 的大概是10W/mL
7 j  B" x  O- d. z- e3 g方法一：20ul的小滴滴在皿盖上，倒扣在皿底，培养48hr， EB如照片所示，EB边界不清楚，形态不圆，分化严重。% \2 X  h$ E8 V( L' v3 P
方法二：将mES悬浮培养在细菌培养皿内，48hr后换液，EB状态同方法一差不多。
; M/ t. |& [& S请大家看看我的步骤有什么不妥的吗？给予指点。
$ |) b, L+ ]. ]! w. g, n$ `: ^7 S4 R8 V& e" A

: \1 i5 @% B0 o# j2 j3 \& ?- P

henryjia

补充一点，LZ说EB‘分化严重’ - 这不准确，因为生成EB的目的就是要诱导ES开始分化。6 N" j( ^9 s# V& Y

6 |8 s  n8 H7 V9 u6 J  @我正在整理以前做的HES分化实验资料，准备改天发一套分化实验图来给大家参考。

henryjia

除上述意见之外，如果仔细观察补充的第三张图，可以清晰地发现很多游离的细胞，且形态大小不规则 - 这是明显的细胞死亡征兆。ES细胞是非常敏感脆弱的，在收获过程中，很多因素可以影响：1，消化酶消化时间，2，离开incubator时间，保温状况。' i0 x* H% Y, w

0 o0 d: [5 S( G/ w( Y1 H) V此外，你所说的‘mES状态还是不错的’ - 是否指形态观察？这往往是不充分的。定期的characterisation 很重要。

erikoapril

可以尝试增加每个液滴的细胞数试试看

梦想lab

ES状态好的话，形成的EB才能好。我用第二种悬浮做过，48hrs观察，发现还是比较均匀的，我种的细胞没那么多

yaoyaoyatou

方法二是直接将ES吹散后悬浮在分化培基里，在细菌培养皿里悬浮培养，48hr后EB很小。比方法一EB要小很多。至于mES状态还是不错的。但是很奇怪EB为什么总是这个状态。

wangzhuo822001

你说的方法二，是不是先由方法一悬滴培养两天，然后再悬浮培养？

双刀

ES细胞的状态很重要，另外的就是，楼主用的FBS用的是哪个牌子的

xiaojunhu1985

这个问题我也遇过。尤其是在ES 状态不好的情况下

xiaojunhu1985

原因1 x( t1 w& s9 Y* ~3 l0 S) d
一：小鼠的ES 状态本身就不好。2 d1 k; ?) m, ^# t
二：做好不要用FBS 培养，很容易贴壁。要使用血清替代物。SR