mES制备EB照片

yaoyaoyatou

大家好！第一次制备EB，感觉很失败，不知道原因在哪里？希望大家能给我指点一下。; A' y, O8 q3 Q4 o: }! d3 q. q
我的EB培养基是：KO-DMEM, FBS,L-glu, NEAA, Pen-strep,meraptoethanol.
# s' y# l5 l2 C2 y* T& smES 的大概是10W/mL8 z# ^9 O( g0 b* j; J8 R* {9 C0 \
方法一：20ul的小滴滴在皿盖上，倒扣在皿底，培养48hr， EB如照片所示，EB边界不清楚，形态不圆，分化严重。
2 N- ^3 _5 Q+ U. Q7 L) w5 U方法二：将mES悬浮培养在细菌培养皿内，48hr后换液，EB状态同方法一差不多。
4 _! [* O0 W. }6 S- U5 s4 l1 a请大家看看我的步骤有什么不妥的吗？给予指点。9 r5 j" r. N( Q# ], b
" M# {3 c6 P4 v5 H. a3 `
8 g$ p# r/ F9 H% X

yaoyaoyatou

补张照片7 [) w! ^" I4 D! m3 U: w9 {

痞子的烟头

作EB之前一定要保证MES或HES状态要好，至于培养基LIF以外，其它都成份都一样
4 d8 ~+ I4 ^/ C还有消化作EB时，不要太过了，

xjya

对于方法一 ，悬滴法，细胞密度一般是20000-40000/ml.小鼠培养基一般20%FBS的高糖含L-glutamin的DMEM。48小时后收集EB的时候要特别小心，用蓝色枪头收集，注意不要反复吹打，以免打散EB。2 f( E3 f+ o9 V3 q7 F
对于方法2，你是想用mass culture法吧。这个方法细胞密度一般是1000000/ml.但是要在摇床上不停的摇才行，48小时后稀释成1000个EB/皿，继续摇，直到相应的时间。
6 o& B: m- I, c0 x9 N: d从你的图中看，大概是吹的太狠了，EB都散架了。
9 q' [: p; c" R# K: y2 X还有一点我不明白，你觉得“EB边界不清楚，形态不圆，分化严重”，为什么说分化严重啊？好像这么说不妥~

wangzhuo822001

关注～～～

xiaojunhu1985

原因* ]6 i4 N1 U2 A  a6 p8 i5 f
一：小鼠的ES 状态本身就不好。
6 C! {/ S. J/ D5 f二：做好不要用FBS 培养，很容易贴壁。要使用血清替代物。SR

xiaojunhu1985

这个问题我也遇过。尤其是在ES 状态不好的情况下

双刀

ES细胞的状态很重要，另外的就是，楼主用的FBS用的是哪个牌子的

wangzhuo822001

你说的方法二，是不是先由方法一悬滴培养两天，然后再悬浮培养？

yaoyaoyatou

方法二是直接将ES吹散后悬浮在分化培基里，在细菌培养皿里悬浮培养，48hr后EB很小。比方法一EB要小很多。至于mES状态还是不错的。但是很奇怪EB为什么总是这个状态。