mES制备EB照片

yaoyaoyatou

大家好！第一次制备EB，感觉很失败，不知道原因在哪里？希望大家能给我指点一下。
9 z9 c0 i# ?! K4 q) u我的EB培养基是：KO-DMEM, FBS,L-glu, NEAA, Pen-strep,meraptoethanol.' b0 ~3 O- ~0 f  n( o0 F
mES 的大概是10W/mL5 e5 O% r9 s; n+ B/ t& ~, \
方法一：20ul的小滴滴在皿盖上，倒扣在皿底，培养48hr， EB如照片所示，EB边界不清楚，形态不圆，分化严重。
4 U  c8 @! P" ~# e8 p) O+ v, A方法二：将mES悬浮培养在细菌培养皿内，48hr后换液，EB状态同方法一差不多。
# |! a8 X5 V. v" ?3 g请大家看看我的步骤有什么不妥的吗？给予指点。: ]) h, S' n! j! u; y0 [3 U6 j1 |% r/ m

2 W  D8 N6 ^( M( @: |  t! t( k* s; ~2 F

yaoyaoyatou

补张照片! L8 f7 d* ~2 B. Z" q3 m" c* i

痞子的烟头

作EB之前一定要保证MES或HES状态要好，至于培养基LIF以外，其它都成份都一样7 S0 _9 L. H+ p' `
还有消化作EB时，不要太过了，

xjya

对于方法一 ，悬滴法，细胞密度一般是20000-40000/ml.小鼠培养基一般20%FBS的高糖含L-glutamin的DMEM。48小时后收集EB的时候要特别小心，用蓝色枪头收集，注意不要反复吹打，以免打散EB。: |% T. A4 e* V0 m
对于方法2，你是想用mass culture法吧。这个方法细胞密度一般是1000000/ml.但是要在摇床上不停的摇才行，48小时后稀释成1000个EB/皿，继续摇，直到相应的时间。
, I3 {$ z4 V* D0 b& O* @从你的图中看，大概是吹的太狠了，EB都散架了。
* r" g4 }. w7 e7 y. E' N% y" d* N还有一点我不明白，你觉得“EB边界不清楚，形态不圆，分化严重”，为什么说分化严重啊？好像这么说不妥~

wangzhuo822001

关注～～～

xiaojunhu1985

原因/ S! T8 g2 G" S( e: t$ ]1 p) w: }
一：小鼠的ES 状态本身就不好。% ^! y* O: O3 n: I" u* F# e
二：做好不要用FBS 培养，很容易贴壁。要使用血清替代物。SR

xiaojunhu1985

这个问题我也遇过。尤其是在ES 状态不好的情况下

双刀

ES细胞的状态很重要，另外的就是，楼主用的FBS用的是哪个牌子的

wangzhuo822001

你说的方法二，是不是先由方法一悬滴培养两天，然后再悬浮培养？

yaoyaoyatou

方法二是直接将ES吹散后悬浮在分化培基里，在细菌培养皿里悬浮培养，48hr后EB很小。比方法一EB要小很多。至于mES状态还是不错的。但是很奇怪EB为什么总是这个状态。