组织石蜡切片免疫荧光背景色过强，如何消除？

小白

9 }3 @9 q7 ]1 a0 k) N

5 a' w$ W7 Y/ p0 E# p6 x具体步骤：& b; c! i$ x+ B" v+ E: K
1.石蜡切片脱蜡复水，枸橼酸缓冲液热修复，pbs洗3次，每次5分钟  t) ]# _* n0 N' b- s
2.10%普通血清（1小时）或者1%BSA（半小时）封闭
. x) o$ E. L  r* v2 e  t# b  ps.两种都试过，结果没有改善
" [2 o/ [: F- Z& `$ `3.加用含0.1%TritonX-100、 1%BSA/PBS封闭液稀释的一抗（1：100）9 l9 P$ h* f, a- ?/ C
  4℃湿盒过夜( D& q# |+ P) k$ l
4.第二天洗掉一抗，PBS洗3次，每次5min2 e$ l, X; m1 w/ Q3 z  d2 `& W( S
加入用含0.1%TritonX-100、 1%BSA/PBS封闭液稀释的二抗（1：500），室温40min，避光  N# {+ H8 c1 P1 w
5.PBS洗掉二抗，3次，每次5min$ R' K7 i1 c6 _: G/ A
6.染核，PBS洗3次，每次5min, J. c* l! G" W! p5 M# F2 S4 U( V
7.封片，荧光显微镜下观察
2 S, z% E+ A$ L9 e- t$ z1 X3 t0 l6 P) d9 J- x# e& a- F
结果背景色很强，阴性对照（一抗换成PBS）也有很强的荧光，一抗是CK系列的抗体。
4 h7 l) ~% n" b: S0 G请教哪些步骤需要改善？

淡定

是不是抗体稀释的问题，换几个梯度试一试

小白

是不是抗体稀释的问题，换几个梯度试一试3 i5 ^; t- n. o" t7 g
淡定 发表于 2010-7-16 13:05

+ k/ o& D; H- f9 i! w
试一试，谢谢！

runsong

abbr_f0f3f63a5a3344da325045ba02d05b53.pdf (567.61 KB)

2010-7-18 14:26 上传

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你的过程和我的基本一样，是不是组织本身自发荧光的问题。% i2 H/ F, y6 `' K! _. k' I2 c  E3 g
可以买lgG做对照，只要和对照有差异结果还是可以用的。) R$ f8 }9 x3 `& F
文章中第十页的图片背景染色也有，有差异就行。

runsong

你是干啥行当的，如果专业做切片做发育的话就留个QQ吧。以后多交流。

小白

你是干啥行当的，如果专业做切片做发育的话就留个QQ吧。以后多交流。
+ K# M8 c/ G' v. m8 mrunsong 发表于 2010-7-18 14:35

- y3 }4 A' W$ T. q1 Z5 W
不是专业做切片的，只是实验里面荧光染色的部分涉及的比较多

小白

9 J  c( J; d3 P, c

你的过程和我的基本一样，是不是组织本身自发荧光的问题。5 `5 U& d$ E$ \& {+ h
可以买lgG做对照，只要和对照有差异结果还是可以 ...
; z% J+ Z4 c' u, W% vrunsong 发表于 2010-7-18 14:27

* R# d$ M! u  d7 w# j
我试过没做任何染色步骤的切片（未脱蜡）在荧光显微镜下面看，就是有自发荧光的，跟阴性对照的强度看起来差不多

cortex

有阴性对照，就成了，你可以把荧光调弱，去处背景荧光就可以了啊。染上色之后，与背景荧光差异很大的。

yueyongheng

楼主可以做一个不加一抗的对照试验，检测一下是不是二抗与切片发生了非特异性反应。
' J6 [0 ?1 ]2 ~5 C1 [. E# N  g另外不解为什么楼主不用PBS/T洗片

大笨鸟

谢谢分享