组织石蜡切片免疫荧光背景色过强，如何消除？

小白

: N0 i( b; C* C. g
" d. A. o6 b' I  }具体步骤：1 ^9 h/ {5 g9 B9 E( E9 D
1.石蜡切片脱蜡复水，枸橼酸缓冲液热修复，pbs洗3次，每次5分钟& j) T0 n( W) k6 v2 F7 A
2.10%普通血清（1小时）或者1%BSA（半小时）封闭
: o$ k% j2 U+ w  ps.两种都试过，结果没有改善; @2 Z5 l& O! ?# \1 y* \5 _
3.加用含0.1%TritonX-100、 1%BSA/PBS封闭液稀释的一抗（1：100）3 w  g# I0 ]) F" {
  4℃湿盒过夜; b- ^- d* K) Q) Y$ U; }
4.第二天洗掉一抗，PBS洗3次，每次5min& z* D) ^$ e4 q7 D/ H
加入用含0.1%TritonX-100、 1%BSA/PBS封闭液稀释的二抗（1：500），室温40min，避光
8 D" J& a8 G* b4 R5.PBS洗掉二抗，3次，每次5min
4 |2 l9 M2 n4 J; Y+ s4 y6 @8 a5 x6.染核，PBS洗3次，每次5min
( t! O) ?$ z( }8 }# i, I7.封片，荧光显微镜下观察; M+ e$ w- ~3 B( {/ u

  O, Q4 e( y- i+ z结果背景色很强，阴性对照（一抗换成PBS）也有很强的荧光，一抗是CK系列的抗体。
: p0 O+ e# t/ R8 T请教哪些步骤需要改善？

淡定

是不是抗体稀释的问题，换几个梯度试一试

小白

是不是抗体稀释的问题，换几个梯度试一试9 I- S/ L& u6 h3 f
淡定 发表于 2010-7-16 13:05

) W, O3 v1 h, z7 w8 T试一试，谢谢！

runsong

abbr_f0f3f63a5a3344da325045ba02d05b53.pdf (567.61 KB)

2010-7-18 14:26 上传

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你的过程和我的基本一样，是不是组织本身自发荧光的问题。2 I, P; @/ N- n$ }
可以买lgG做对照，只要和对照有差异结果还是可以用的。
3 V+ g. ~( m0 k) O文章中第十页的图片背景染色也有，有差异就行。

runsong

你是干啥行当的，如果专业做切片做发育的话就留个QQ吧。以后多交流。

小白

你是干啥行当的，如果专业做切片做发育的话就留个QQ吧。以后多交流。8 g  c( f* {. v) q
runsong 发表于 2010-7-18 14:35

" N4 V$ q6 u0 M. K' N2 t
不是专业做切片的，只是实验里面荧光染色的部分涉及的比较多

小白

! W6 w7 {9 W' ^7 G  ^8 K8 X# g

你的过程和我的基本一样，是不是组织本身自发荧光的问题。! K  n; Q* l, E6 X" w2 g2 e
可以买lgG做对照，只要和对照有差异结果还是可以 ...  U* n! X' j' @9 s+ U
runsong 发表于 2010-7-18 14:27

' [# J( d3 K* @4 [
我试过没做任何染色步骤的切片（未脱蜡）在荧光显微镜下面看，就是有自发荧光的，跟阴性对照的强度看起来差不多

cortex

有阴性对照，就成了，你可以把荧光调弱，去处背景荧光就可以了啊。染上色之后，与背景荧光差异很大的。

yueyongheng

楼主可以做一个不加一抗的对照试验，检测一下是不是二抗与切片发生了非特异性反应。
0 h5 k' O4 |: E5 y5 K另外不解为什么楼主不用PBS/T洗片

大笨鸟

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