组织石蜡切片免疫荧光背景色过强，如何消除？

小白

) M, j- X1 W& Y0 v

" F% v% E: ]: K5 {具体步骤：% x2 b: c5 ^9 v- X% s- j+ G. q
1.石蜡切片脱蜡复水，枸橼酸缓冲液热修复，pbs洗3次，每次5分钟* ?7 r) V* p- B" ~( a* |
2.10%普通血清（1小时）或者1%BSA（半小时）封闭+ j* g# v6 L2 r% _, j' O; E
  ps.两种都试过，结果没有改善
4 Y; ~. W6 O# F! x: ?/ ^( N3.加用含0.1%TritonX-100、 1%BSA/PBS封闭液稀释的一抗（1：100）
. l- |/ Q8 {  d' M  4℃湿盒过夜( G% b. f) M% u/ [. u0 a
4.第二天洗掉一抗，PBS洗3次，每次5min
; L. Z) d; N! o3 _! R% A加入用含0.1%TritonX-100、 1%BSA/PBS封闭液稀释的二抗（1：500），室温40min，避光
& V- ?! ?5 q+ ]/ g7 e. x5.PBS洗掉二抗，3次，每次5min
: Q& U$ t' U/ }* Y1 L* Y: z1 h" _6.染核，PBS洗3次，每次5min
- P! ~( H' U6 {# b, B% |7.封片，荧光显微镜下观察
; S1 l, f4 d$ \- U8 B- d9 e8 S$ r) d* u1 h( z
结果背景色很强，阴性对照（一抗换成PBS）也有很强的荧光，一抗是CK系列的抗体。9 Q" }. f  e% ~& H
请教哪些步骤需要改善？

淡定

是不是抗体稀释的问题，换几个梯度试一试

小白

是不是抗体稀释的问题，换几个梯度试一试: a" Y# [& {! b! u+ R" a/ T
淡定 发表于 2010-7-16 13:05

" X2 }2 k( F' `7 W' b
试一试，谢谢！

runsong

abbr_f0f3f63a5a3344da325045ba02d05b53.pdf (567.61 KB)

2010-7-18 14:26 上传

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你的过程和我的基本一样，是不是组织本身自发荧光的问题。. O6 ~! a( T7 O8 k; c
可以买lgG做对照，只要和对照有差异结果还是可以用的。* Q  k% M+ W- E. j2 O% m0 |& ^6 O
文章中第十页的图片背景染色也有，有差异就行。

runsong

你是干啥行当的，如果专业做切片做发育的话就留个QQ吧。以后多交流。

小白

你是干啥行当的，如果专业做切片做发育的话就留个QQ吧。以后多交流。
' z( h- v2 Q2 S) i% orunsong 发表于 2010-7-18 14:35

: A) X$ B: i- x不是专业做切片的，只是实验里面荧光染色的部分涉及的比较多

小白

, Y6 W& W) @$ t! ?$ G2 G- q

你的过程和我的基本一样，是不是组织本身自发荧光的问题。- ]. \7 h* k  k$ x6 E1 I, F
可以买lgG做对照，只要和对照有差异结果还是可以 ...
4 u- e% {6 m' d$ D$ \runsong 发表于 2010-7-18 14:27

7 }" D' G$ p% q* Q! k0 {* w
我试过没做任何染色步骤的切片（未脱蜡）在荧光显微镜下面看，就是有自发荧光的，跟阴性对照的强度看起来差不多

cortex

有阴性对照，就成了，你可以把荧光调弱，去处背景荧光就可以了啊。染上色之后，与背景荧光差异很大的。

yueyongheng

楼主可以做一个不加一抗的对照试验，检测一下是不是二抗与切片发生了非特异性反应。
& U5 e0 k9 z: N5 q另外不解为什么楼主不用PBS/T洗片

大笨鸟

谢谢分享