组织石蜡切片免疫荧光背景色过强，如何消除？

小白

8 j: V: y7 C5 S- [' G

' O0 b0 B/ z1 K% \具体步骤：" o) ?) Q3 H, g% F
1.石蜡切片脱蜡复水，枸橼酸缓冲液热修复，pbs洗3次，每次5分钟$ M5 I: B/ w) @+ z6 H
2.10%普通血清（1小时）或者1%BSA（半小时）封闭
; B- f7 Z7 E! B  ps.两种都试过，结果没有改善: R2 \& c# e( x( N  l3 ~/ D& Z) K6 c& y
3.加用含0.1%TritonX-100、 1%BSA/PBS封闭液稀释的一抗（1：100）' k0 P3 r. w4 h6 R7 [( b8 N+ C
  4℃湿盒过夜9 L  m1 ~' q) t& x' p$ a' K" E
4.第二天洗掉一抗，PBS洗3次，每次5min
7 |- j: T4 @- `, \9 Q) j, G4 W加入用含0.1%TritonX-100、 1%BSA/PBS封闭液稀释的二抗（1：500），室温40min，避光' j8 l% H; ~' p; s" S7 K* u4 M
5.PBS洗掉二抗，3次，每次5min
  F- B" z( p2 D# {" f6.染核，PBS洗3次，每次5min
1 W; u- I( m! n6 P9 w5 F7.封片，荧光显微镜下观察& J$ }( r8 L' @" ?* X2 `! @

7 Y( {0 G  K$ L8 B5 q8 O结果背景色很强，阴性对照（一抗换成PBS）也有很强的荧光，一抗是CK系列的抗体。# n+ m3 ?" U2 o! I
请教哪些步骤需要改善？

淡定

是不是抗体稀释的问题，换几个梯度试一试

小白

是不是抗体稀释的问题，换几个梯度试一试
: [8 |# H' r3 r) o$ p  Q1 }淡定 发表于 2010-7-16 13:05

5 V. y. ~! L$ B) Y- G/ u, n/ R
试一试，谢谢！

runsong

abbr_f0f3f63a5a3344da325045ba02d05b53.pdf (567.61 KB)

2010-7-18 14:26 上传

请用IE浏览器下载
附件
下载积分: 威望 -2 , 包包 -5

你的过程和我的基本一样，是不是组织本身自发荧光的问题。7 X4 T+ C2 U6 X/ |+ }* y6 q" v" i/ e
可以买lgG做对照，只要和对照有差异结果还是可以用的。
' K/ C- l4 b4 V  h/ r: f/ \: D6 W- }文章中第十页的图片背景染色也有，有差异就行。

runsong

你是干啥行当的，如果专业做切片做发育的话就留个QQ吧。以后多交流。

小白

你是干啥行当的，如果专业做切片做发育的话就留个QQ吧。以后多交流。: W; M9 @! S$ H0 ~
runsong 发表于 2010-7-18 14:35

5 |% ^) d* `: i) q$ e& z
不是专业做切片的，只是实验里面荧光染色的部分涉及的比较多

小白

2 o& j4 u6 R7 i! H

你的过程和我的基本一样，是不是组织本身自发荧光的问题。& t& c. k8 Q+ T7 ~& ], b: v
可以买lgG做对照，只要和对照有差异结果还是可以 ...
9 Z4 ]" s( G0 f- Mrunsong 发表于 2010-7-18 14:27

* }3 a* E; q, |# v& _/ p
我试过没做任何染色步骤的切片（未脱蜡）在荧光显微镜下面看，就是有自发荧光的，跟阴性对照的强度看起来差不多

cortex

有阴性对照，就成了，你可以把荧光调弱，去处背景荧光就可以了啊。染上色之后，与背景荧光差异很大的。

yueyongheng

楼主可以做一个不加一抗的对照试验，检测一下是不是二抗与切片发生了非特异性反应。* c: E0 ~$ Q% r  Z9 Z/ t4 ?( K
另外不解为什么楼主不用PBS/T洗片

大笨鸟

谢谢分享