组织石蜡切片免疫荧光背景色过强，如何消除？

小白

# ?/ ^& Y, [8 B* _. C1 B7 a8 D/ {) j, n* s# Y
具体步骤：) a5 X+ E4 ?- B* ]/ j8 F6 @+ q
1.石蜡切片脱蜡复水，枸橼酸缓冲液热修复，pbs洗3次，每次5分钟0 U4 ?6 T2 W  U" U# d- V4 N5 W
2.10%普通血清（1小时）或者1%BSA（半小时）封闭6 x, ?. Z1 o* X
  ps.两种都试过，结果没有改善" j. O0 Z" a" w$ ^9 l* t) O$ X, d$ d
3.加用含0.1%TritonX-100、 1%BSA/PBS封闭液稀释的一抗（1：100）
# |. d* X/ V! ~7 f  4℃湿盒过夜
6 z; K6 S# R$ G8 M) Q2 L! a) M4.第二天洗掉一抗，PBS洗3次，每次5min
& q- E: a. u: O; K加入用含0.1%TritonX-100、 1%BSA/PBS封闭液稀释的二抗（1：500），室温40min，避光6 Z$ \0 k; B7 v  x* R* z
5.PBS洗掉二抗，3次，每次5min
7 g' e% M" q$ ^# n6.染核，PBS洗3次，每次5min5 M) o, E9 O* _
7.封片，荧光显微镜下观察
  y* Y/ B8 K) l# r8 u# \' ~! ]
! W5 m; C' O! ~' d1 q( N, d" l结果背景色很强，阴性对照（一抗换成PBS）也有很强的荧光，一抗是CK系列的抗体。5 w$ u% d' q( G: e
请教哪些步骤需要改善？

淡定

是不是抗体稀释的问题，换几个梯度试一试

小白

是不是抗体稀释的问题，换几个梯度试一试
$ m- H; S4 M' ]: A淡定 发表于 2010-7-16 13:05

, P2 ]6 O; n6 V8 ]# G$ o试一试，谢谢！

runsong

abbr_f0f3f63a5a3344da325045ba02d05b53.pdf (567.61 KB)

2010-7-18 14:26 上传

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你的过程和我的基本一样，是不是组织本身自发荧光的问题。' L8 l5 G. z! U6 j. a$ F5 D, p0 d
可以买lgG做对照，只要和对照有差异结果还是可以用的。
' ~+ }3 y4 x3 ?) s文章中第十页的图片背景染色也有，有差异就行。

runsong

你是干啥行当的，如果专业做切片做发育的话就留个QQ吧。以后多交流。

小白

你是干啥行当的，如果专业做切片做发育的话就留个QQ吧。以后多交流。' v1 J( |: }5 G/ Y6 S
runsong 发表于 2010-7-18 14:35

" \8 n$ d" N+ x5 B: R4 W不是专业做切片的，只是实验里面荧光染色的部分涉及的比较多

小白

0 Q7 o' {, q, `5 s. A- n6 N' [

你的过程和我的基本一样，是不是组织本身自发荧光的问题。  Q) d/ `- @- i/ B' R, o
可以买lgG做对照，只要和对照有差异结果还是可以 ...; k8 Z! P% R$ N9 J* g# |0 O" T8 x+ @
runsong 发表于 2010-7-18 14:27

* q+ _5 o  B+ K: j) j4 g" F
我试过没做任何染色步骤的切片（未脱蜡）在荧光显微镜下面看，就是有自发荧光的，跟阴性对照的强度看起来差不多

cortex

有阴性对照，就成了，你可以把荧光调弱，去处背景荧光就可以了啊。染上色之后，与背景荧光差异很大的。

yueyongheng

楼主可以做一个不加一抗的对照试验，检测一下是不是二抗与切片发生了非特异性反应。& J+ k% C' I0 q! {
另外不解为什么楼主不用PBS/T洗片

大笨鸟

谢谢分享