组织石蜡切片免疫荧光背景色过强，如何消除？

小白

3 |$ l2 n. n7 G! ]( t5 w. x* s

& I- Y/ K6 [+ E& A$ _: h( s  {具体步骤：$ u+ b  k$ E$ H. O; T
1.石蜡切片脱蜡复水，枸橼酸缓冲液热修复，pbs洗3次，每次5分钟! p- e( @' G, m; J; a; s3 j
2.10%普通血清（1小时）或者1%BSA（半小时）封闭
) m* o: \  @5 _* q" Z  ps.两种都试过，结果没有改善  x* Y7 G/ n2 p4 r0 S
3.加用含0.1%TritonX-100、 1%BSA/PBS封闭液稀释的一抗（1：100）
; t7 T5 u" w  L  4℃湿盒过夜' C, q  f, H2 L8 U: [' W& M
4.第二天洗掉一抗，PBS洗3次，每次5min6 }) P! E. e6 _3 M* T% F& l
加入用含0.1%TritonX-100、 1%BSA/PBS封闭液稀释的二抗（1：500），室温40min，避光: I' n2 r* d$ S, Z# O  C
5.PBS洗掉二抗，3次，每次5min9 E7 w! T! c# z* W  K3 o
6.染核，PBS洗3次，每次5min
2 Z7 S; n& |. E; ^% l2 U7.封片，荧光显微镜下观察. P- {2 r' B, [4 Y$ U% t: V$ h

0 q2 j( O3 {, U1 t/ z" k结果背景色很强，阴性对照（一抗换成PBS）也有很强的荧光，一抗是CK系列的抗体。. {/ ?. j4 g& L0 s% ~- E1 O3 a
请教哪些步骤需要改善？

淡定

是不是抗体稀释的问题，换几个梯度试一试

小白

是不是抗体稀释的问题，换几个梯度试一试
+ W( y; F9 U7 N9 @0 L淡定 发表于 2010-7-16 13:05

3 r' k) U! j6 F! L( n7 Y# Q4 m试一试，谢谢！

runsong

abbr_f0f3f63a5a3344da325045ba02d05b53.pdf (567.61 KB)

2010-7-18 14:26 上传

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你的过程和我的基本一样，是不是组织本身自发荧光的问题。
. s3 S: N9 @# B7 h& t$ L, C可以买lgG做对照，只要和对照有差异结果还是可以用的。* L; r" ?: Q/ }3 K" v, f, \- ?6 M! n, [
文章中第十页的图片背景染色也有，有差异就行。

runsong

你是干啥行当的，如果专业做切片做发育的话就留个QQ吧。以后多交流。

小白

你是干啥行当的，如果专业做切片做发育的话就留个QQ吧。以后多交流。8 W  m: D  h) A+ p+ p
runsong 发表于 2010-7-18 14:35

& w- V# w& b$ b, o0 I- x
不是专业做切片的，只是实验里面荧光染色的部分涉及的比较多

小白

+ l$ t( f- v) g4 ~0 h. J

你的过程和我的基本一样，是不是组织本身自发荧光的问题。6 S! w7 P. i. P/ i
可以买lgG做对照，只要和对照有差异结果还是可以 ...
5 ]$ J3 M/ W$ n5 e( \- g/ z6 G4 krunsong 发表于 2010-7-18 14:27

3 h4 ~) N, V: Z; _9 P! f  \* p9 V8 b我试过没做任何染色步骤的切片（未脱蜡）在荧光显微镜下面看，就是有自发荧光的，跟阴性对照的强度看起来差不多

cortex

有阴性对照，就成了，你可以把荧光调弱，去处背景荧光就可以了啊。染上色之后，与背景荧光差异很大的。

yueyongheng

楼主可以做一个不加一抗的对照试验，检测一下是不是二抗与切片发生了非特异性反应。
! d6 p# r- g) Z" K9 P另外不解为什么楼主不用PBS/T洗片

大笨鸟

谢谢分享