组织石蜡切片免疫荧光背景色过强，如何消除？

小白

% O- k  A2 ]1 @$ E- i
. x: l0 h  E7 c6 `具体步骤：
5 x( _  N- c) W4 G  n, k1.石蜡切片脱蜡复水，枸橼酸缓冲液热修复，pbs洗3次，每次5分钟* `4 h  |  q4 m) N
2.10%普通血清（1小时）或者1%BSA（半小时）封闭
) m! y) `- r2 E! f2 ?6 q' _- o" ]  ps.两种都试过，结果没有改善( e# [1 h; z) @3 C# ^
3.加用含0.1%TritonX-100、 1%BSA/PBS封闭液稀释的一抗（1：100）* u5 O4 X/ Y. k0 i
  4℃湿盒过夜
3 K- P) ~: T8 ?4 q2 m4.第二天洗掉一抗，PBS洗3次，每次5min6 w+ _( y5 N9 h0 Z* y; w
加入用含0.1%TritonX-100、 1%BSA/PBS封闭液稀释的二抗（1：500），室温40min，避光
+ i% I0 I4 t! I9 v7 c5.PBS洗掉二抗，3次，每次5min6 V& o% O* `: O' L' J/ P+ ?' k# C. ]2 l
6.染核，PBS洗3次，每次5min
; A# T* b" ^+ I: m: V7.封片，荧光显微镜下观察& ]3 ]" q( {8 S
; |) g' M2 s+ F  b* r
结果背景色很强，阴性对照（一抗换成PBS）也有很强的荧光，一抗是CK系列的抗体。( w! i3 A' r& G& b
请教哪些步骤需要改善？

淡定

是不是抗体稀释的问题，换几个梯度试一试

小白

是不是抗体稀释的问题，换几个梯度试一试
0 ~4 c1 ~4 A) s1 D淡定 发表于 2010-7-16 13:05

. f. u5 u1 S& [( g' b$ m) y3 @! q试一试，谢谢！

runsong

abbr_f0f3f63a5a3344da325045ba02d05b53.pdf (567.61 KB)

2010-7-18 14:26 上传

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你的过程和我的基本一样，是不是组织本身自发荧光的问题。: V  n: N$ V0 Y+ r
可以买lgG做对照，只要和对照有差异结果还是可以用的。
% _" Y7 S5 A/ T& D文章中第十页的图片背景染色也有，有差异就行。

runsong

你是干啥行当的，如果专业做切片做发育的话就留个QQ吧。以后多交流。

小白

你是干啥行当的，如果专业做切片做发育的话就留个QQ吧。以后多交流。
+ W- Q- M* C4 c1 K1 P5 frunsong 发表于 2010-7-18 14:35

: W5 N0 b: Z. d! J4 U* O不是专业做切片的，只是实验里面荧光染色的部分涉及的比较多

小白

7 u* K8 ]7 x; w+ K

你的过程和我的基本一样，是不是组织本身自发荧光的问题。/ Q4 R; B) {" z/ |, {
可以买lgG做对照，只要和对照有差异结果还是可以 .../ r3 o5 a; i7 M
runsong 发表于 2010-7-18 14:27

6 q5 ^) ~' ^& N; m/ e
我试过没做任何染色步骤的切片（未脱蜡）在荧光显微镜下面看，就是有自发荧光的，跟阴性对照的强度看起来差不多

cortex

有阴性对照，就成了，你可以把荧光调弱，去处背景荧光就可以了啊。染上色之后，与背景荧光差异很大的。

yueyongheng

楼主可以做一个不加一抗的对照试验，检测一下是不是二抗与切片发生了非特异性反应。/ S* R9 G3 m* Q% |; `
另外不解为什么楼主不用PBS/T洗片

大笨鸟

谢谢分享