MSC污染

aristolal23

先谢谢各位同学了，我的情况是这样的，自从6月份以来，每次取MSC的时候都会在不同的时间段出现细胞污染，有的是在原代就出现，有的是长到第一代，或者第二代，小弟非常困惑，希望能得到各位的指点。2 R1 T; x. \' z  K) v/ |- k: ~! m
我取的过程大概是这样的。. o! }  V5 F( o/ A+ I
1 SD大鼠3-4周处死，用乙醇（100%）的浸泡5-10分钟，然后拿到超净台去两个大腿，去皮，用PBS洗十遍，然后用纱布把肉撕掉，再用PBS洗10遍，然后取细胞，我一般取骨垢端以及大腿的骨髓，取完以后放入离心管，800转，8分钟，然后用培养液吹起来，放入六孔板中，一般一个大腿一个六孔板，然后72小时或者96小时以后换液，传代。% n, k3 [. V4 U! I
我所用的培养液是高糖DMEM,血清是GIBCO的，浓度是10%，加双抗。
7 g) c6 u' O: v! P& l% ~* E请大家看看哪里出现问题了。

maozhuxiwo1

6 D/ G7 R3 ]7 q& K/ H& b  v) J+ G$ z
细胞污染 是什么程度的？酒精浓度在75%是杀菌效果最好的。浓度高的酒精会在细菌等表面产生一层膜，不会杀死它& E6 k; H8 B3 T
你的800转 是提取的什么细胞啊？我们都是1800  半小时，然后用PBS1800 5分钟洗2此，没有你开头洗那么多次。; I' r0 ~; m# Z( O& w$ E  ^
如果是细胞状态不好，你也可以找找血清的原因，MSC对血清要求特别高。
# ^) c. i3 }& ~( w# {6 x3 n( `& o还有就是··· MSC是要用LG养的吧？HG很容易分化的，我们都用阿发MEM) p" w; C" b1 J% z3 f: {; U2 V$ c
不知道这些能不能帮你找到问题所在

aristolal23

乙醇75%,   PBS加5-10倍培养基中抗生素浓度
/ N2 b0 W9 J' w* rdaviddow 发表于 2010-7-21 17:54

3 R+ Q5 n$ x- {8 c& f& g

- a- v0 ]$ W9 S- F
% o1 h: O/ U0 @) e- S# L8 g' H$ l    好的，谢谢了

aristolal23

一来PBS冲洗没必要冲10次吧？
  Y  [* X0 \" R7 \7 a* |  k4 |2 F( g' f- K  `+ A  n
二来，过多的多余步骤必然带来污染风险
5 y+ m2 }! }7 d( b
) j& d2 L! v* }$ c, H, p: Y' n考虑到你之前操作并不污染，所以 ...) S% h% G- J, L% W1 q8 o9 s- W$ M$ n
zhmgeneral 发表于 2010-7-21 17:53

5 ^, d* N) O0 a* x2 f
+ z) c/ }3 ?2 B7 Y# |
. L* M! ?' M1 S+ ]( P    恩，好的，谢谢了

aristolal23

细胞污染的因素很多，首先你要保证不能发生人为因素引起的污染，主要是操作污染，实验器械或试剂消毒不干净 ...
0 ~! R+ A# \& x  V9 Nanxjs 发表于 2010-7-21 16:48

+ P  Y+ i/ y5 P1 `; _4 O
; d/ I' w- i2 T% v) M/ s! S! Y& f# W
) j( p' B1 D4 ^* e    哦，好的，谢谢你的建议

daviddow

乙醇75%,   PBS加5-10倍培养基中抗生素浓度

zhmgeneral

一来PBS冲洗没必要冲10次吧？, b" B+ z4 d( W3 o6 q/ a3 }& @0 a* P

1 f' o- i, T0 p( O2 p+ i二来，过多的多余步骤必然带来污染风险
0 g1 b: V8 K( m( ^
/ k6 T1 w& ?" ~; F; E, @/ B( ^, h考虑到你之前操作并不污染，所以建议你对比以前和最近操作的中，所用器械、器材有无变化

anxjs

细胞污染的因素很多，首先你要保证不能发生人为因素引起的污染，主要是操作污染，实验器械或试剂消毒不干净，还有就是实验室工作环境，排除这些因素后，再引起污染，可能就是动物本身问题了。看你的情况，入实验室应该不长，操作要注意了。8 E; q: L9 M7 X3 t2 z2 e
再看看你原代取材过程，首先乙醇用100%就是错误的，消毒一般70-75%，100%是脱水用的。再如果污染频繁，建议大腿去皮，以及把肉撕掉后，用含5%双抗的PBS清洗5min以上。大鼠MSC原代换液，48-72h为佳。96小时偏长了点。

aristolal23

额，过程木有问题。应该与楼主操作或者培养箱有关吧。2 r6 a/ T8 A0 p2 H7 V: K$ ?- v# [
另外，为什么楼主用的是高糖的DMEM，高糖不是会导致 ...1 R4 p5 j% K* N2 c& _
deron 发表于 2010-7-21 15:29

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" j, s% T3 O0 H( ]1 Y7 W

) A. q' i8 `8 _3 U, F$ X) J    呵呵，以前一直用高糖了，但感觉细胞状态不错，就没有用过低糖。

aristolal23

要说明一下出现的污染是什么污染，细胞污染可能是多方面的原因造成的，如人员操作、环境是否无菌、分离培养 ...2 J. p% {- R* n) M4 v
yuangaoqian 发表于 2010-7-21 15:25

. G) M( Y) {3 P- S$ v" K
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    个人感觉和我的操作有关，但又不好说，6月之前我取细胞从来都没有过污染，还教别人，但六月以后，噩梦就开始了，唉。
. X, z8 _# h) K( a+ |) V+ \; ~' l2 O   污染的情况我没有照照片，下次如果出现再发给你们，之前的情况是有细条的小虫出现，找老师看，说可能是黑胶原虫。还有的情况是细胞长着长着，就有黑点出现。