MSC污染

aristolal23

先谢谢各位同学了，我的情况是这样的，自从6月份以来，每次取MSC的时候都会在不同的时间段出现细胞污染，有的是在原代就出现，有的是长到第一代，或者第二代，小弟非常困惑，希望能得到各位的指点。
: |8 N; w6 O' F6 }1 {9 h我取的过程大概是这样的。; j( {; D2 r* Q! o* L3 h7 g
1 SD大鼠3-4周处死，用乙醇（100%）的浸泡5-10分钟，然后拿到超净台去两个大腿，去皮，用PBS洗十遍，然后用纱布把肉撕掉，再用PBS洗10遍，然后取细胞，我一般取骨垢端以及大腿的骨髓，取完以后放入离心管，800转，8分钟，然后用培养液吹起来，放入六孔板中，一般一个大腿一个六孔板，然后72小时或者96小时以后换液，传代。4 u+ d  T5 p) `  \2 h, g
我所用的培养液是高糖DMEM,血清是GIBCO的，浓度是10%，加双抗。
2 H4 a2 s6 Z( x: ~- J- g请大家看看哪里出现问题了。

guosapphire

个人认为可将换液时间缩短一些，因为双抗只是抑制细菌的，时间长的话有些细菌就会产生抗药性，那就麻烦了。另外，建议原代的时候提高双抗的浓度。

franklinhg

乙醇75%试一试   PBS加2倍培养基中抗生素浓度  纱布不用  我一般是剪刀和镊子直接上 冲洗出来骨髓后 无菌筛网200目过滤后  离心1000g3分钟 25度  然后重悬 接种一般一只大鼠我接种一个T75 5-7天长的很好

franklinhg

培养基在加入10%血清和抗生素后 再次过滤 试一试

franklinhg

现在市面上的培养基假货很多

yuangaoqian

要说明一下出现的污染是什么污染，细胞污染可能是多方面的原因造成的，如人员操作、环境是否无菌、分离培养用具是否无菌以及培养基是否无菌等，而且污染也包括多种污染，如微生物、细菌、真菌、支原体、病毒等，有些是认为操作才能造成的，有些是血清等带有的，所以，最好说详细一点，最好附图。

deron

额，过程木有问题。应该与楼主操作或者培养箱有关吧。
. f  p' i5 _4 r另外，为什么楼主用的是高糖的DMEM，高糖不是会导致MSC分化吗

aristolal23

个人认为可将换液时间缩短一些，因为双抗只是抑制细菌的，时间长的话有些细菌就会产生抗药性，那就麻烦了。 ...* Z$ f5 }" \  v/ C
guosapphire 发表于 2010-7-21 15:20

$ ]5 ]$ g  k6 p- [5 q3 F9 q- j

! F& ?5 H1 Q2 O, y. G谢谢你的建议' Y  d# V( V4 h1 F4 a
    如果换液的时间短了，细胞一般72小时以内细胞感觉帖不上

aristolal23

乙醇75%试一试   PBS加2倍培养基中抗生素浓度  纱布不用  我一般是剪刀和镊子直接上 冲洗出来骨髓后 无菌筛 ...
$ ~) _( V$ P. u3 C; a2 Qfranklinhg 发表于 2010-7-21 15:21

" G. f! n2 T& o* V6 {& S, ?% T2 i  M, i9 z0 c/ O, Y. P

3 z# o+ p) _  m- Y* O/ L    谢谢你的建议- d. S0 m0 N4 h4 l" y. d9 I! O
   我下次试一试。我估计可能和纱布撕扯有关，即使纱布消毒了。

aristolal23

现在市面上的培养基假货很多
; k8 ]* t% q8 G) w5 Q+ @2 s6 vfranklinhg 发表于 2010-7-21 15:22

# U2 ~. B4 p- ?2 }+ s/ ~

6 r+ z" P3 C% w/ t9 w' C' Y8 K: K0 ^+ @  A# t% l; z( c, j. s
    我们经常通过这公司买，已经建立了很好的关系了，这个可以排除，呵呵。