MSC污染

aristolal23

先谢谢各位同学了，我的情况是这样的，自从6月份以来，每次取MSC的时候都会在不同的时间段出现细胞污染，有的是在原代就出现，有的是长到第一代，或者第二代，小弟非常困惑，希望能得到各位的指点。/ j; o$ R5 v0 V7 F; @1 S4 P
我取的过程大概是这样的。8 r3 a4 e' M% \. `
1 SD大鼠3-4周处死，用乙醇（100%）的浸泡5-10分钟，然后拿到超净台去两个大腿，去皮，用PBS洗十遍，然后用纱布把肉撕掉，再用PBS洗10遍，然后取细胞，我一般取骨垢端以及大腿的骨髓，取完以后放入离心管，800转，8分钟，然后用培养液吹起来，放入六孔板中，一般一个大腿一个六孔板，然后72小时或者96小时以后换液，传代。# B  Z. e( G0 V+ E
我所用的培养液是高糖DMEM,血清是GIBCO的，浓度是10%，加双抗。
3 u) x% y5 T+ f. p# `请大家看看哪里出现问题了。

guosapphire

个人认为可将换液时间缩短一些，因为双抗只是抑制细菌的，时间长的话有些细菌就会产生抗药性，那就麻烦了。另外，建议原代的时候提高双抗的浓度。

franklinhg

乙醇75%试一试   PBS加2倍培养基中抗生素浓度  纱布不用  我一般是剪刀和镊子直接上 冲洗出来骨髓后 无菌筛网200目过滤后  离心1000g3分钟 25度  然后重悬 接种一般一只大鼠我接种一个T75 5-7天长的很好

franklinhg

培养基在加入10%血清和抗生素后 再次过滤 试一试

franklinhg

现在市面上的培养基假货很多

yuangaoqian

要说明一下出现的污染是什么污染，细胞污染可能是多方面的原因造成的，如人员操作、环境是否无菌、分离培养用具是否无菌以及培养基是否无菌等，而且污染也包括多种污染，如微生物、细菌、真菌、支原体、病毒等，有些是认为操作才能造成的，有些是血清等带有的，所以，最好说详细一点，最好附图。

deron

额，过程木有问题。应该与楼主操作或者培养箱有关吧。
7 [/ ?$ _( P+ t; A/ }) H另外，为什么楼主用的是高糖的DMEM，高糖不是会导致MSC分化吗

aristolal23

个人认为可将换液时间缩短一些，因为双抗只是抑制细菌的，时间长的话有些细菌就会产生抗药性，那就麻烦了。 ...
* M3 s9 p$ s; y& ]" N2 F/ V. cguosapphire 发表于 2010-7-21 15:20

3 y8 @, y4 Y0 F5 H& y" M2 D

( |2 n' L8 H+ s6 z谢谢你的建议! V8 _6 M5 g0 `
    如果换液的时间短了，细胞一般72小时以内细胞感觉帖不上

aristolal23

乙醇75%试一试   PBS加2倍培养基中抗生素浓度  纱布不用  我一般是剪刀和镊子直接上 冲洗出来骨髓后 无菌筛 ...* z* j+ L% l! F
franklinhg 发表于 2010-7-21 15:21

$ Q7 u& O# ^5 q+ Z6 r* s& \6 t6 L# F6 U. x

# [/ h& V( s0 s2 p) Q- u1 u* ]    谢谢你的建议
( ?$ L1 }: S# s   我下次试一试。我估计可能和纱布撕扯有关，即使纱布消毒了。

aristolal23

现在市面上的培养基假货很多5 s! t- Y. Z5 u# O2 Y& c
franklinhg 发表于 2010-7-21 15:22

. ?$ a4 G1 P% D: F, k/ y+ Z
/ D8 {* f9 e4 h9 `5 b: c  r0 W9 @# S- t4 o  v; G
    我们经常通过这公司买，已经建立了很好的关系了，这个可以排除，呵呵。