MSC污染

aristolal23

先谢谢各位同学了，我的情况是这样的，自从6月份以来，每次取MSC的时候都会在不同的时间段出现细胞污染，有的是在原代就出现，有的是长到第一代，或者第二代，小弟非常困惑，希望能得到各位的指点。8 [% V$ k* L! K/ e) b1 A# V
我取的过程大概是这样的。
" u" o3 ^6 m9 i0 t1 SD大鼠3-4周处死，用乙醇（100%）的浸泡5-10分钟，然后拿到超净台去两个大腿，去皮，用PBS洗十遍，然后用纱布把肉撕掉，再用PBS洗10遍，然后取细胞，我一般取骨垢端以及大腿的骨髓，取完以后放入离心管，800转，8分钟，然后用培养液吹起来，放入六孔板中，一般一个大腿一个六孔板，然后72小时或者96小时以后换液，传代。- N% y6 b9 c+ _& ~
我所用的培养液是高糖DMEM,血清是GIBCO的，浓度是10%，加双抗。
8 R2 \7 g! c/ O2 j1 _请大家看看哪里出现问题了。

aristolal23

个人认为可将换液时间缩短一些，因为双抗只是抑制细菌的，时间长的话有些细菌就会产生抗药性，那就麻烦了。 ...* L( F& U' ^4 a+ ]
guosapphire 发表于 2010-7-21 15:20

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1 M$ r) B4 V7 ]# M
谢谢你的建议
# O, ^7 u1 j, l' d3 i    如果换液的时间短了，细胞一般72小时以内细胞感觉帖不上

aristolal23

乙醇75%试一试   PBS加2倍培养基中抗生素浓度  纱布不用  我一般是剪刀和镊子直接上 冲洗出来骨髓后 无菌筛 ...$ y1 d9 i4 H; `# }" }; L4 {) j, M
franklinhg 发表于 2010-7-21 15:21

  Q2 A3 Q& s% m  L/ S
/ m$ s- v* S' o" V! C0 P

6 _8 [3 ]5 @4 y/ e1 A$ @1 G5 U    谢谢你的建议
8 U" `, Y* y' c$ N! x3 O   我下次试一试。我估计可能和纱布撕扯有关，即使纱布消毒了。

aristolal23

现在市面上的培养基假货很多) P  J: f+ I. ^& p' I. H# X7 c. g
franklinhg 发表于 2010-7-21 15:22

3 l& @' z7 A$ a& C1 a" P$ p
! M& G- y) V; X) j+ g. f* T/ p
6 z) B. I4 @, X) r, ?0 o# q    我们经常通过这公司买，已经建立了很好的关系了，这个可以排除，呵呵。

aristolal23

要说明一下出现的污染是什么污染，细胞污染可能是多方面的原因造成的，如人员操作、环境是否无菌、分离培养 .... A7 |( Y+ B* ]; t6 B  d
yuangaoqian 发表于 2010-7-21 15:25

% p. F  C$ N) P* D9 g% ?. M
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$ M/ g/ g7 A" n- L# f3 x3 r* j    个人感觉和我的操作有关，但又不好说，6月之前我取细胞从来都没有过污染，还教别人，但六月以后，噩梦就开始了，唉。
0 E' K( w$ g$ n2 r& j   污染的情况我没有照照片，下次如果出现再发给你们，之前的情况是有细条的小虫出现，找老师看，说可能是黑胶原虫。还有的情况是细胞长着长着，就有黑点出现。

aristolal23

额，过程木有问题。应该与楼主操作或者培养箱有关吧。2 S# m0 m3 k6 Z6 Z/ Y; H
另外，为什么楼主用的是高糖的DMEM，高糖不是会导致 ...$ d% S* E  N7 `" V0 m( Q: k: P
deron 发表于 2010-7-21 15:29

5 T5 F; [9 K# h: y4 |. r8 k
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5 T3 x0 c' u8 y' M( n" O    呵呵，以前一直用高糖了，但感觉细胞状态不错，就没有用过低糖。

aristolal23

细胞污染的因素很多，首先你要保证不能发生人为因素引起的污染，主要是操作污染，实验器械或试剂消毒不干净 ...
% Y2 ?' x$ Y* q# Lanxjs 发表于 2010-7-21 16:48

4 R+ {4 I2 R. C. `5 ~1 t/ l( p# Q% e2 O
' }' v; ]3 k" {6 a( I; S
    哦，好的，谢谢你的建议

aristolal23

一来PBS冲洗没必要冲10次吧？
1 y( U2 r% o5 V4 m0 @: l) E# X; [3 L( S/ x4 a/ d1 J
二来，过多的多余步骤必然带来污染风险, C- r& r; m: y( {$ U
- p. k* ~* P2 Z- w$ e4 }
考虑到你之前操作并不污染，所以 ..., k) w$ d: ?/ C) ~  l/ m
zhmgeneral 发表于 2010-7-21 17:53

% u: l4 J/ u* U9 ~! e  d
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    恩，好的，谢谢了

aristolal23

乙醇75%,   PBS加5-10倍培养基中抗生素浓度
2 [$ `( y( m5 `daviddow 发表于 2010-7-21 17:54

& b3 E) H+ d- B( S# K1 ~
- B! P- G9 V+ Y3 R0 {& Y3 @: ~6 E6 t

! r* b0 {) O3 x# ]9 G    好的，谢谢了