hESC复苏后传代方法

farmer

大家能否讨论一下hESC复苏后传代的方法，比如何时传代、用什么酶、消化时间、如何分离分化细胞和未分化细胞等等。

懵懂干细胞

(一)预铺feeder：（以T25培养瓶为例）- q2 X- Z( f+ D: I
通常提前两天铺feeder
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" H  d3 b/ s5 B/ E  {1：预先在培养瓶中铺上基质胶（matri gel）。# c' |$ A# ?- A. M0 o

* Y1 K/ }" h4 z) K9 S3 Z2：复苏feeder细胞：复苏流程：将冻存管从液氮中取出，迅速至于37度的水中，摇晃使冻存液完全溶解。% @9 M2 ?/ M% o# a2 u* `
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3：铺feeder细胞：根据预实验将相应数量的feeder细胞加到10％DMEM培养基中，混匀。37度培养箱培养，在临使用前需要用hES培基洗涤一次，才能传入hES细胞。9 [& }+ s) J1 D8 f9 s  ~( l
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(二)hESC传代：
5 m* m% H+ _( H( |: d6 q; G1：先将培养瓶内的废液吸弃。* c8 o# u( m$ y: E" Q4 m: g% P
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2：将大约3－4ml胶原酶Ⅳ加入瓶中。（24孔板加500ul）5 l! O8 O1 V1 A! S
3：将T25瓶重新放回37度培养箱中，放置约20min－30min。
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4：消化期间对于铺了feeder用来传代的培养瓶，吸弃10％DMEM，加入少量hES培养基洗涤，吸弃hES培养基，然后加入6ml新的hES培养基，以备传代。( L9 w: O2 T- G. z& }

/ z! t) M; Y/ P5：待克隆消化下来后，取出培养瓶，将瓶中液体连同脱落的克隆移到15ml离心管里。加入2ml的hES培养基以终止消化反应。待细胞沉降下来后，吸弃上清废液；再用2ml的hES（或ESO）培基洗一次细胞（即吹打重悬），待细胞沉降下来后，吸弃上清；加入2mlhES培液吹打克隆到适合大小，然后根据自己需要按比例传代。
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( j  g8 Y. X+ R2 C( x/ O6：传代后的注意事项* k9 _% e3 K3 j7 c8 x1 P
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1）传代后的第一天，不需更换新的medium，从第二天起，每天换液。0 D0 o7 d2 ~6 I) _4 ]- o

- g1 M& c$ y% B8 o2 ?  2）传代周期为6－7days，但要视细胞状态而定，传代可以改善细胞状态。* @4 r4 h) Q4 \7 S" l9 [
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  3）传代的前三天预铺feeder# \* _/ D2 Y* C6 k8 `8 g+ }
HESC没养过！这是我从网站上找的，参考

sfk06

对于一个新的细胞各种条件都是要在培养的过程中慢慢摸索的，一般细胞涨到80左右就可以传代了，至于用的酶就要问问，买之前用什么样的了 或者慢慢自己摸索

guo5598214520

受教，谢谢

cony

学习了。

exin11

回复 2# 懵懂干细胞 ! P# C7 U- A7 r+ k+ w
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3 p, t% A% V3 W5 _    thanks for sharing with us

farmer

回复 2# 懵懂干细胞 % |) v  u$ p, b5 x' q; f
7 c- i' E7 v/ Y& z" k
传代时如何分离已分化细胞和未分化细胞，如果不分离传代效果是否会受到影响？

yxh295

正是我所需要。

supergama

通常刚复苏的hESC比较脆弱，且出现较多的分化，需要先调整好状态再进一步实验，所以我们通常先用机械划块法进行挑选移除或挑选保留，待细胞生长稳定后可用胶原酶或invitrogen的TrypleE酶传代，但酶传代次数过多容易出现非正常核型，一般不用胰酶，但经过驯化的hESC可用胰酶传代。

ruofan1982

我们是胶原酶消化25-30分钟之后，收集克隆，洗2至3遍后，用1ml的注射器针头机械性切割，然后再种。
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在镜下通过形态可以初步大概判断分化和未分化的细胞，
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8 M  D8 b) M) _# J不过机械性切割很麻烦，也想用吹的办法，但是吹的效果不是很理想，你们是怎么吹的？