求助：有没有人做过鸡胚成纤维细胞的培养，求经验

coralqin

在2001年刚进实验室的时候几乎每天做这个实验，翻出以前的实验记录，整理了下，希望对你有用：  T- s  l6 `3 [& b* s2 }
鸡胚胎成纤维细胞的制备
% `5 u" k/ R/ q0 F2 ?1. 取9～10日龄的鸡胚，用碘酒和酒精消毒，在超净工作台内，小心取出鸡胚，放在无菌培养皿中，除去头部、翅膀及内脏；7 y* w$ U' z( N: Z0 M
2. 胚体用PBS冲洗2～3次，切成1～2mm3的小块，然后转入容积适量大小的三角瓶内；
! d& J: m/ R9 ]/ K. H2 s3. 按每个鸡胚加入15mL的EDTA-胰酶消化液，在室温下消化6～8 min；
9 p4 M/ {* ~: Q  A0 q( Y4. 小牛血清终止消化，收集细胞悬液，没有消化完全的组织块可再消化一次；/ l# i: J6 D7 ^5 Q( A$ \
5. 收集到的细胞悬液经100目过滤筛过滤，180g离心5 min，去上清；& y7 h" C* `, v. ]! K# w* \+ E
6. 细胞沉淀用DMEM培养液重新悬浮，取出少量细胞悬液台盼蓝染色，计算细胞活力；6 m( P: a% o* g
7. 以5×105个/mL的密度接种到培养瓶中，于38.5℃、5%CO2浓度、饱和湿度条件下培养。+ B/ r! ?. m. `1 W! U+ J3 }0 N
鸡胚胎成纤维细胞的传代
. i, ~! `  Y) ~5 p1. 原代培养的细胞铺满培养瓶底部时，即可进行传代；
- Y# r- {% S3 B# R# O2. 吸出原培养液，然后用PBS清洗细胞2～3次，尽量除去残余的血清；  W; }1 ]* s& A7 h6 Q, V
3. 加入0.2 mL的EDTA-胰酶消化液进行消化，消化程度可在倒置显微镜下观察，一般以细胞突起缩回、细胞间间隙增大、细胞近乎缩成圆形为度，终止消化。. {* v" i# T# ^
4. 吸出消化液，加入适量的含小牛血清的培养液，反复轻轻吹打培养瓶底部，使经消化的细胞脱离瓶底并分散为单个细胞；
* c; V* [4 h* c# q9 @5. 收集细胞悬液，180g离心5min，去上清；
& W; s5 A5 k: A+ r6 U6 e6. 用培养液重新悬浮细胞并计算细胞活力和密度，以5×105个/mL密度接种到培养瓶中，于37.5℃、5%CO2浓度、饱和湿度条件下培养。

coralqin

如果你打算用鸡成纤维细胞作为feeder, 建议选取3代左右的，细胞纯度高，分泌的细胞因子也足。: U- l" f8 ?/ B/ T  P
饲养层细胞的制备
9 i( J5 ]. t7 K: Y/ ]) I1. 选取生长良好、传至第2～3代的成纤维细胞，吸出原培养液，换成含有10µg/ml丝裂霉素-C的培养液，在培养箱中作用2.5 h；4 a3 `: ^  }0 c* h8 |& x3 p
2. 吸出含丝裂霉素-C的培养液，用PBS洗涤饲养层细胞7～8次；- X, ^# o0 x! S7 e0 g) V' a
3. 加入0.2 mL的消化液进行消化，消化程度可在倒置显微镜下观察，一般以细胞突起缩回、细胞间间隙增大、细胞近乎缩成圆形为度；+ Y9 h3 k/ ?. Y, g5 R, U( A
4. 吸出消化液，加入适量的含小牛血清的培养液，反复轻轻吹打培养瓶底部，使经消化的细胞脱离瓶底并分散为单个细胞；
' ]9 Z* Y! C2 Q0 Y8 q" r/ X7 D( _( b5. 收集细胞悬液，180g离心5min，去上清；
- q. |: A' b  t: i, l: [. V6. 用培养液重新悬浮细胞并计算细胞活力和密度，以1×106个/mL密度接种到培养板中，于37.5℃、5%CO2浓度、饱和湿度条件下培养；, }( C) j" w5 `2 C
7. 待细胞贴壁后进行观察。如果细胞过稀，须补加处理过的细胞，以保证细胞连成一片；
. S3 T8 Y8 v( r8. 制备好的饲养层细胞放在培养箱中备用。5 d内使用。