求助：有没有人做过鸡胚成纤维细胞的培养，求经验

honeyliubei

我第一次做这个培养，想求点经验。谢谢各位了

coralqin

在2001年刚进实验室的时候几乎每天做这个实验，翻出以前的实验记录，整理了下，希望对你有用：( Y( y$ T/ v6 t+ e( C& Z
鸡胚胎成纤维细胞的制备9 }+ s% r9 c7 |- J6 x8 @
1. 取9～10日龄的鸡胚，用碘酒和酒精消毒，在超净工作台内，小心取出鸡胚，放在无菌培养皿中，除去头部、翅膀及内脏；
0 m0 ]0 J8 V+ M. E# K9 x+ Y6 C7 s+ J2. 胚体用PBS冲洗2～3次，切成1～2mm3的小块，然后转入容积适量大小的三角瓶内；# ]) |  K- y' u( ~/ f+ ^  A5 S2 l
3. 按每个鸡胚加入15mL的EDTA-胰酶消化液，在室温下消化6～8 min；0 m) v3 r9 {1 o$ n" [
4. 小牛血清终止消化，收集细胞悬液，没有消化完全的组织块可再消化一次；
1 z3 d0 B- W: v7 p5. 收集到的细胞悬液经100目过滤筛过滤，180g离心5 min，去上清；
$ i; w% h9 _$ j/ h2 P6. 细胞沉淀用DMEM培养液重新悬浮，取出少量细胞悬液台盼蓝染色，计算细胞活力；
+ d5 K7 H/ K( [" Y& q: C1 K7. 以5×105个/mL的密度接种到培养瓶中，于38.5℃、5%CO2浓度、饱和湿度条件下培养。
6 ]& f: B; \+ N1 f鸡胚胎成纤维细胞的传代1 a1 f$ f4 p+ i. m! A
1. 原代培养的细胞铺满培养瓶底部时，即可进行传代；
6 F0 a* K6 ~2 y2. 吸出原培养液，然后用PBS清洗细胞2～3次，尽量除去残余的血清；
# O( A! W8 O& o+ H3. 加入0.2 mL的EDTA-胰酶消化液进行消化，消化程度可在倒置显微镜下观察，一般以细胞突起缩回、细胞间间隙增大、细胞近乎缩成圆形为度，终止消化。) R$ v: r* ^- z7 Z  L
4. 吸出消化液，加入适量的含小牛血清的培养液，反复轻轻吹打培养瓶底部，使经消化的细胞脱离瓶底并分散为单个细胞；6 P' S* T* @8 L; M( o& m5 l
5. 收集细胞悬液，180g离心5min，去上清；  M4 h- A: j" y% m% a
6. 用培养液重新悬浮细胞并计算细胞活力和密度，以5×105个/mL密度接种到培养瓶中，于37.5℃、5%CO2浓度、饱和湿度条件下培养。

coralqin

如果你打算用鸡成纤维细胞作为feeder, 建议选取3代左右的，细胞纯度高，分泌的细胞因子也足。3 O; s) G2 B$ j, j+ o2 |4 \& b4 i
饲养层细胞的制备  ]1 b5 A7 D- i2 n9 p$ `! Y
1. 选取生长良好、传至第2～3代的成纤维细胞，吸出原培养液，换成含有10µg/ml丝裂霉素-C的培养液，在培养箱中作用2.5 h；
0 ?" ?( W2 S: g+ }2. 吸出含丝裂霉素-C的培养液，用PBS洗涤饲养层细胞7～8次；
/ @/ q5 V& \6 O' F3. 加入0.2 mL的消化液进行消化，消化程度可在倒置显微镜下观察，一般以细胞突起缩回、细胞间间隙增大、细胞近乎缩成圆形为度；
" M8 f: ~" T# G% Z: N4. 吸出消化液，加入适量的含小牛血清的培养液，反复轻轻吹打培养瓶底部，使经消化的细胞脱离瓶底并分散为单个细胞；; Q* O$ c" {$ _( |/ D* s4 \+ p
5. 收集细胞悬液，180g离心5min，去上清；
% B* x" q1 S# H+ }6. 用培养液重新悬浮细胞并计算细胞活力和密度，以1×106个/mL密度接种到培养板中，于37.5℃、5%CO2浓度、饱和湿度条件下培养；1 ^1 M- d& N  s, B1 L2 F7 z' \2 c
7. 待细胞贴壁后进行观察。如果细胞过稀，须补加处理过的细胞，以保证细胞连成一片；
. f8 o- K! z: Q) W; A$ O& d% ?/ ]1 j8. 制备好的饲养层细胞放在培养箱中备用。5 d内使用。