求助：有没有人做过鸡胚成纤维细胞的培养，求经验

honeyliubei

我第一次做这个培养，想求点经验。谢谢各位了

coralqin

在2001年刚进实验室的时候几乎每天做这个实验，翻出以前的实验记录，整理了下，希望对你有用：* Y$ O, J. Z$ N) W
鸡胚胎成纤维细胞的制备) C) _3 i' f& n6 X
1. 取9～10日龄的鸡胚，用碘酒和酒精消毒，在超净工作台内，小心取出鸡胚，放在无菌培养皿中，除去头部、翅膀及内脏；1 m0 i- d4 g7 K1 Q1 L
2. 胚体用PBS冲洗2～3次，切成1～2mm3的小块，然后转入容积适量大小的三角瓶内；1 S2 {; Q( G: Y5 C, e
3. 按每个鸡胚加入15mL的EDTA-胰酶消化液，在室温下消化6～8 min；" [" L/ n+ h# Q# ~3 N! y
4. 小牛血清终止消化，收集细胞悬液，没有消化完全的组织块可再消化一次；
0 L$ v% t3 |9 k6 y$ _. b' h" G5. 收集到的细胞悬液经100目过滤筛过滤，180g离心5 min，去上清；" i6 V& j. o6 B- t3 l
6. 细胞沉淀用DMEM培养液重新悬浮，取出少量细胞悬液台盼蓝染色，计算细胞活力；1 N4 K; a2 N- U9 s( K) P! I& t
7. 以5×105个/mL的密度接种到培养瓶中，于38.5℃、5%CO2浓度、饱和湿度条件下培养。3 o4 S7 @1 S% x
鸡胚胎成纤维细胞的传代: f+ g6 ?  V, L9 D2 R9 O
1. 原代培养的细胞铺满培养瓶底部时，即可进行传代；; d+ t* {9 N4 O
2. 吸出原培养液，然后用PBS清洗细胞2～3次，尽量除去残余的血清；
7 k6 f' T/ A% l. K: K( k/ f3. 加入0.2 mL的EDTA-胰酶消化液进行消化，消化程度可在倒置显微镜下观察，一般以细胞突起缩回、细胞间间隙增大、细胞近乎缩成圆形为度，终止消化。6 e* J" V, D" t! W# \& T8 R
4. 吸出消化液，加入适量的含小牛血清的培养液，反复轻轻吹打培养瓶底部，使经消化的细胞脱离瓶底并分散为单个细胞；
* y2 Q1 Y- m' |5 }. X; v4 B5. 收集细胞悬液，180g离心5min，去上清；  d3 C5 v, ?7 z6 L7 F8 D
6. 用培养液重新悬浮细胞并计算细胞活力和密度，以5×105个/mL密度接种到培养瓶中，于37.5℃、5%CO2浓度、饱和湿度条件下培养。

coralqin

如果你打算用鸡成纤维细胞作为feeder, 建议选取3代左右的，细胞纯度高，分泌的细胞因子也足。
. u+ k  Z9 w2 \* p7 U; y! D饲养层细胞的制备# s; [' K8 Y  f4 l7 \$ x5 B
1. 选取生长良好、传至第2～3代的成纤维细胞，吸出原培养液，换成含有10µg/ml丝裂霉素-C的培养液，在培养箱中作用2.5 h；
: f1 d1 p7 {# h, F3 ^( g6 g2. 吸出含丝裂霉素-C的培养液，用PBS洗涤饲养层细胞7～8次；
% C/ P8 S; \, y& K3. 加入0.2 mL的消化液进行消化，消化程度可在倒置显微镜下观察，一般以细胞突起缩回、细胞间间隙增大、细胞近乎缩成圆形为度；
: B/ ]$ f/ Z+ |, @, o# `4. 吸出消化液，加入适量的含小牛血清的培养液，反复轻轻吹打培养瓶底部，使经消化的细胞脱离瓶底并分散为单个细胞；
7 J7 V- T: ?. |4 [! J5 n: t2 g5. 收集细胞悬液，180g离心5min，去上清；
9 a5 D4 W: y( p+ J# w6. 用培养液重新悬浮细胞并计算细胞活力和密度，以1×106个/mL密度接种到培养板中，于37.5℃、5%CO2浓度、饱和湿度条件下培养；* ~% \+ ?. P9 v  k' q
7. 待细胞贴壁后进行观察。如果细胞过稀，须补加处理过的细胞，以保证细胞连成一片；
3 D2 W0 O  `9 H, v: d6 }8. 制备好的饲养层细胞放在培养箱中备用。5 d内使用。