请教几个iPS细胞转染的问题！

zhaoyan1983

1.通常情况下病毒载体先转化到大肠杆菌感受态中进行扩增，之后用脂质体包裹转染到293FT细胞中，之后再转染如MEF细胞，请问为什么不直接转染MEF?293FT在转染过程中起着什么作用？为什么先要转到它的里面？
9 o: t5 t6 }; g, ~2.病毒载体整合到受体细胞基因组时，是整个载体序列全部整合还是载体中的其中一部分序列整合？例如植物中就是农杆菌质粒中的左右T-边界之间整合到植物基因组中，而载体中的其余部分不整合，但不知病毒是如何整合的？还有是线性整合的吗？
5 V. i- d! w$ s$ u0 c1 |3.Oct-4、klf4、c-myc、Sox2是利用一个载体转染的还是四个病毒载体分别转染的？是一个启动子还是四个启动子？  U8 [% o6 x! O: p$ c$ }
4.对iPS传代后形成的iPS集落，可以说一个集落就是一个细胞系吗？

guosapphire

1.直接转染MEF的问题我认为主要有两点a.转染效率比较低，b.转染后转基因的表达持续时间不够长。当然YAMANAKA使用质粒转染MEF直接制备IPS的文章在08年已经发表了，但是效率还是比较低的。
( L: _" H3 W2 z2 ]1 ?2 x2. 当然是部分序列整合入宿主基因组的。具体机制根据载体不同请自己查找说明（逆转录病毒与慢病毒有所不同）。% `. j5 T: C9 g4 ^
3. 最初的时候，是制备四种单独的病毒来共同转染的。后来改进为携带4基因的一种病毒。病毒表达后四个转录因子直接以可被水解的短肽连接，水解后可在细胞内形成4个所需的转录因子。
( D/ J6 F. F" |' ^/ q" I& ^( s/ c4. 可以所一个集落就是一个系（如果是以慢病毒或逆转录病毒法制备的）。因为病毒感染的时候其整合的位点，及每个被感染的细胞获得的病毒数量是不一致，具有随机性。所以，每个集落的基因组可能是不一样。 当然，使用非基因组整合型方法获得是IPS集落，不同集落可能就是相同的细胞，可以称为同一细胞系了。

zhaoyan1983

回复 2# guosapphire
* s- f  K# F% U- q6 D
& S6 y% x) e7 ?$ A0 d: U请问293FT在转染过程中起着什么作用？为什么先要转到它的里面？

treestem

回复 3# zhaoyan1983
0 V1 v, o# B& r9 {( P2 g
- z/ @# ~' R( O" y- q+ O% gguosapphire讲的很好了，293系细胞（293T,293FT等）转染效率高，作用是制备大量病毒，再感染MEF，制备iPS细胞时，病毒滴度要求很高

zhaoyan1983

它在大肠杆菌里不就可以大量制备了吗 那干嘛还要在293里再大量制备一次啊？请指教

guosapphire

回复 5# zhaoyan1983 9 y0 u, v: L% A6 M& x( l! a/ U& l/ ^7 w
细致的说，MEF-->IPS需要转基因，就是想办法使得MEF表达那四个因子（当然现在很多方法可以不使用那四个因子了，我们先说这个典型的四因子方法）。如果想把外源基因导入MEF，大致目前有3类办法：1。脂质体法（有细胞毒性）；2。病毒法；3。电转法。其中1和3可以直接把外源基因使用物理方法导入MEF的，但是其效率相对低或者对MEF的损伤大，另外其导入后外源基因的表达持续时间比较短，不能随细胞分裂而扩增。  
' _) E, E# U* n; l. L2 R( Q关于使用病毒的办法，那么就要先制备病毒了。出于安全考虑，目前制备病毒（主要指逆转录病毒和慢病毒）的方法主要原则是：将合成病毒颗粒主要组成部分的基因分别克隆到3-4个载体上，这些载体在进入293细胞后会分别制造出病毒的外壳和核酸，然后包装成成熟的病毒颗粒（这个病毒是经过人工修饰的，已经丧失了感染宿主细胞后进行复制的能力）。我们感染MEF的时候使用的就是293生产处的病毒颗粒。
1 B7 O2 U4 m9 o) G4 Y4 E; R5 p0 L2 b& B关于为什么不在大肠杆菌中扩增的问题，因为大肠杆菌是原核生物，病毒的复制生产需要寄生于真核细胞的基因表达体系。 为什么选293呢？我们制备病毒的时候当然是希望产的越多越好， 293具有代谢快，增殖能力强 的特点，所以在特定时间能产毒能力比较强，另外293是一类非常容易被转基因的细胞，其同时获得3-4个外源基因效率相对较高。
+ p( Q; m3 O( Z8 U3 N% X希望能使你明白。

wangyimei

讲的真好！