养的鼠胚胎干细胞总污染

宇光十色

我养鼠的胚胎干细胞没多久，最近总是出现大肠杆菌的污染，估计是操作过程有问题，特向各位大侠请教！$ W. C% }8 N+ Q1 a8 R
请热心的大侠传授下经验，越详细越好，谢谢！

qianqianlaile

培养基中可以加入双抗，100U/ml青霉素和100U/ml链霉素。链霉素1U=1微克。一般医院的青霉素为80万U/瓶，链霉素为1g/瓶。4 u4 s  `/ j/ g/ g4 C: u1 v
一般市售青霉素为80万单位/瓶，将其溶解于4ml三蒸水中；链霉素为1g/瓶，将其溶解于5ml中。
# {- b/ y, n& Y可分别取4ml青链霉素配成混和液，这样青链霉素的浓度各为10万单位/ml,然后将8ml溶液稀释十倍，青链霉素的浓度各为1万单位/ml，用时可向培养液中加入1%的双抗，即可达到终浓度为100单位/ml.

qianqianlaile

也有已经添加了双抗的培养基出售，和普通培养基价格一样

supergama

何以见得是大肠杆菌的污染？跑过PCR吗？建议先把抗生素撤了，把污染源找到，一个环节一个环节的找，该扔的扔，该灭菌的灭菌，不行的话实验停下来重新配一套体系。一般mES培养中最容易出问题的是MEF，而最要小心的是支原体等隐性污染。

懵懂干细胞

你好！其实在我们干细胞之家里面已经有很多关于细胞污染方面的帖子了！你可以在搜索栏里面搜索一下参考参考！
9 q8 D% L. R( U) S: r  N! P4 G7 \' y, @1 F; V3 T3 X
这里面有一些相关知识希望对你有帮助！

juan880929

Gibco已经有100x浓储的双抗，可以买过来加一下，再有就是看看是不是培养基有问题，总污染同一种菌一般情况下是培养基的问题。再有就是看看是不是本来冻存的ES就有问题。可以用已经配好的培养基养一下成纤维细胞，如果还污染就是培养基问题，如果不污染了就是本来冻存的细胞有问题。

cony

1，培养液配制过程中有无问题？这个很容易解决，开新的就是了。: [2 I2 s9 b: J/ X/ v
2，接种ES前MEF是否有问题？8 `, o1 x- }$ ]+ O7 @
3，操作，器械，
& F, k0 a5 |1 K, A% m) i+ Y9 d4，实验环境，感觉这个比较重要，前段时间我们也总污染，后来发现是别人在取样时带菌进来了，彻底清洁消毒，% ]' C* [2 _' T. l. ^
5，培养箱，至少一个月消毒一次，" h# S, |7 `$ |2 L9 D
个人觉得细菌污染还是比较易控制的，最麻烦的要数支原体和真菌。

宇光十色

回复 2# qianqianlaile
" k" v% }0 V$ w0 x' U( y# I0 l: f7 G- O3 x

/ ^! u( b2 d3 K# I, H    谢谢！培养基中一直都加入了P/S，但还是没有扛住 呵呵

宇光十色

回复 4# supergama / B, N. |0 z6 {$ g8 P
4 @8 I! D* i) P& A- ?  x
恩 在高倍镜下看是杆状小动物在游动，师兄说是大肠杆菌。

宇光十色

回复 5# 懵懂干细胞 1 Y# I) n. u& `! t5 ^+ ?6 E
+ t0 |# U2 A% G' f. o4 [; O

4 r4 Y; ~0 y9 o+ l* S& }& @1 D    非常感谢！