酶切后电泳条带很淡怎么办？

sidalin301

酶切后电泳条带很淡怎么办？
- M: Z# O  W" K8 H3 l  n/ r& |20ul体系，2ul质粒，1.5%的琼脂糖胶，上样10ul，跑30分钟，结果显示条带很淡，怎么样才能使条带清晰？请有经验的大虾指点一下，多谢了！

深海寂寞鱼

to sidalin301：" \# e# ]% C) H: S( J
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   假设你是用含有EB的琼脂糖凝胶进行的电泳，如果其他操作都没有任何问题的话，# W3 h; h" f( O: F; {" T
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   那么你最终条带的亮度只和你DNA的量有关，不知道你有没有测过质粒的浓度。4 J4 ]* i! T' T- }& U& z

4 X. R/ u- j2 T   你用2ul的质粒进行的酶切（20ul体系），上样10ul，等于你在一个well里上样了1ul质粒。如果你酶切前的质粒浓度大于100ng/ul的话，那么既使对于5mm宽的comb，应该都能看见条带的。" C- @$ ^8 P9 l4 c/ }: r

4 m1 N0 j: n! S5 _% k   我觉得你应该从一下几方面分析你实验的问题：; L3 K% `7 U6 r9 W  q5 n

- L# |, J2 K2 H$ Y! X   1.对你的质粒进行定量，看看浓度和纯度如何。3 l/ r3 n0 o0 U# D' F: q) ?  N6 u
3 m0 |- U% {% e8 a0 A2 M
   2.根据你定量的结果，重新进行酶切。对于5mm宽的well，上样量控制在100ng/well以上。  ~3 s9 i/ j6 j$ @  s" Y
, X, U" ~/ Q; p. w# O" U, t( ]
   3.排除EB或者EB浓度的问题。6 P$ D) ]  R" {3 U/ P/ j: q

  Q+ y$ p# _9 O. `6 ]+ k   4.你照相的时候有没有试着调整曝光时间，如果你觉得条带很淡，可以在机器上试着调整曝光时间。6 n1 k( M  F7 p! L* O) g
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   你可以先试着从以上几方面着手找找原因。根据具体情况再做调整。

sidalin301

回复 2# 深海寂寞鱼   [: E: Q4 k* Q3 K( J' p
+ {5 U" v: A# i" I0 U

" V# o9 P3 ?9 N! g6 d, n    多谢了，真是经验丰富啊，佩服，佩服！

懵懂干细胞

顶一个！应该是浓度的问题！

chleiwu

可以加大上样量，也可以加大PCR循环数

hljzyydx

上面这个人没事吧，这是要疯啊$ \; S$ s6 [3 g- W7 x& M2 c4 R
对于这种情况一般两个原因：如果你电泳条件选择没有问题的话可能是质粒浓度比较低，你可以尝试把质粒转化到工程菌种，重新挑取单克隆，这样再次摇菌，重新提取质粒，虽然麻烦，但是浓度可能会高一些！当然如果你原始菌液有很多就没必要这样

sidalin301

多谢各位热心人的帮助，我找到了问题的原因。4 d% b$ N2 t( |  _& ?! f
我以前以为酶切体系里面质粒的量不能超过体系的十分之一，后来发现自己弄错了，是限制酶的量不能超过体系的十分之一，这样的话可以在体系里面多加一些质粒，问题就迎刃而解了。
' m# s/ x) o8 ], u0 ^% M& n不过还有一个问题请教各位，摇菌的时候能不能挑多个克隆？为什么要挑单克隆？反正质粒都不会发生突变的，大肠杆菌变不变无所谓吧？

绿雪

回复 7# sidalin301 : t+ E0 y- }$ N! X. I
; C# J. m! u# X2 X' ~4 _; u

% w. e, g  s9 Y# q    能多挑几个，但是要分别扩大，毕竟有太多不确定的因素呀。如果像你说的，质粒不会改变，那你为什么要多挑几个呢？

sidalin301

回复 8# 绿雪
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5 E0 ?  Q9 Z1 \7 G, c' F$ u2 ^多挑几个是为了扩增的更快，这样做不科学吗？难道一定要分开扩增？

绿雪

回复 9# sidalin301
5 v+ y9 H7 G$ _" Y2 s: P1 f/ w* X$ N% Z7 N( _' ^% ?

& @4 u3 [; w* h. t7 S2 M2 }/ I9 D    大肠杆菌长得很快的，完全没必要这么做的。挑了单克隆到500ul培养基里面，摇两三个小时就可以见到浑浊了，再按1:1000接种到新的培养基里面，摇过夜，绝对足够你抽质粒的。如果你急着要抽质粒，那么也可以把这500ul全部接种到新的培养基，很快就可以达到所需菌体量了，就不用摇过夜了。& j1 R/ t" Z, A6 R  [% [
关于为什么要挑单克隆，这是很好理解的：一个板上长出来的东西不一定都是一样的，在实验过程中很多因素会影响到结果，特别是做连接产物的转化。当然，如果你是用抽提出来的质粒做转化，这种差异相对要小很多。) o& K5 e0 u9 c8 e: w; `4 I
呵呵，做实验不要太急躁，多不了几个钟的。如果不够严谨，出了不正常的结果就不知该怎么解释了，也不好解决问题呀。