酶切后电泳条带很淡怎么办？

sidalin301

酶切后电泳条带很淡怎么办？4 J" [. z9 ?' {
20ul体系，2ul质粒，1.5%的琼脂糖胶，上样10ul，跑30分钟，结果显示条带很淡，怎么样才能使条带清晰？请有经验的大虾指点一下，多谢了！

绿雪

回复 9# sidalin301 7 g. `6 {3 w3 }- s% S

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    大肠杆菌长得很快的，完全没必要这么做的。挑了单克隆到500ul培养基里面，摇两三个小时就可以见到浑浊了，再按1:1000接种到新的培养基里面，摇过夜，绝对足够你抽质粒的。如果你急着要抽质粒，那么也可以把这500ul全部接种到新的培养基，很快就可以达到所需菌体量了，就不用摇过夜了。
7 ~; i# @" p/ f1 [( g1 r关于为什么要挑单克隆，这是很好理解的：一个板上长出来的东西不一定都是一样的，在实验过程中很多因素会影响到结果，特别是做连接产物的转化。当然，如果你是用抽提出来的质粒做转化，这种差异相对要小很多。1 V2 Q5 S- O0 E0 N1 F2 d
呵呵，做实验不要太急躁，多不了几个钟的。如果不够严谨，出了不正常的结果就不知该怎么解释了，也不好解决问题呀。

sidalin301

回复 8# 绿雪
; t& ]1 l' T4 M" e/ w: v, y4 e0 h3 l- ]! v# @, s, ]) b, X! H! ^
多挑几个是为了扩增的更快，这样做不科学吗？难道一定要分开扩增？

绿雪

回复 7# sidalin301
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" z; L( a* r9 l/ W3 }2 G! p
    能多挑几个，但是要分别扩大，毕竟有太多不确定的因素呀。如果像你说的，质粒不会改变，那你为什么要多挑几个呢？

sidalin301

多谢各位热心人的帮助，我找到了问题的原因。
1 w- L- q0 u* M我以前以为酶切体系里面质粒的量不能超过体系的十分之一，后来发现自己弄错了，是限制酶的量不能超过体系的十分之一，这样的话可以在体系里面多加一些质粒，问题就迎刃而解了。% \* x2 G; q8 g7 |
不过还有一个问题请教各位，摇菌的时候能不能挑多个克隆？为什么要挑单克隆？反正质粒都不会发生突变的，大肠杆菌变不变无所谓吧？

hljzyydx

上面这个人没事吧，这是要疯啊) C2 k. B; {, s+ ^
对于这种情况一般两个原因：如果你电泳条件选择没有问题的话可能是质粒浓度比较低，你可以尝试把质粒转化到工程菌种，重新挑取单克隆，这样再次摇菌，重新提取质粒，虽然麻烦，但是浓度可能会高一些！当然如果你原始菌液有很多就没必要这样

chleiwu

可以加大上样量，也可以加大PCR循环数

懵懂干细胞

顶一个！应该是浓度的问题！

sidalin301

回复 2# 深海寂寞鱼 ' i8 j! D( e1 x& {& Z. g

; ~$ Z" q& H  G9 L+ a+ O& k- b& M9 [. C
    多谢了，真是经验丰富啊，佩服，佩服！

深海寂寞鱼

to sidalin301：$ t8 s0 q6 Z- V" z4 \# B  p) C
* j0 a* s* X( V! n- U7 s) F
   假设你是用含有EB的琼脂糖凝胶进行的电泳，如果其他操作都没有任何问题的话，
) N% G1 q- S( v& a7 s- z! k; N
' W) K, D* |- W+ n: {. z* u* B1 z$ ~   那么你最终条带的亮度只和你DNA的量有关，不知道你有没有测过质粒的浓度。2 H) }* }& D) c2 ^5 l) G9 I# S, Q' |& Y

/ X( d3 H& S0 I7 T4 V0 b4 e! k9 W; I   你用2ul的质粒进行的酶切（20ul体系），上样10ul，等于你在一个well里上样了1ul质粒。如果你酶切前的质粒浓度大于100ng/ul的话，那么既使对于5mm宽的comb，应该都能看见条带的。9 P( C5 ~- L& w* G
2 v/ b  |! W4 z7 }- A6 R) f6 e% K# W
   我觉得你应该从一下几方面分析你实验的问题：1 H/ l6 _9 f% ~2 o1 x5 i' k% L8 d- K
' v' `! l6 h" j5 h9 O% d" C+ E
   1.对你的质粒进行定量，看看浓度和纯度如何。% Y+ l$ }! s+ `
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   2.根据你定量的结果，重新进行酶切。对于5mm宽的well，上样量控制在100ng/well以上。6 o8 I' b- t( Q! y, K
, o* W( L1 r3 L4 f
   3.排除EB或者EB浓度的问题。' B* A1 I" |9 f, s3 ?0 G/ D
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   4.你照相的时候有没有试着调整曝光时间，如果你觉得条带很淡，可以在机器上试着调整曝光时间。8 e/ t/ [, w2 t2 m+ @; g: y- Z7 U
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   你可以先试着从以上几方面着手找找原因。根据具体情况再做调整。