酶切后电泳条带很淡怎么办？

sidalin301

酶切后电泳条带很淡怎么办？8 ]* G( z, W1 o' r: b2 J
20ul体系，2ul质粒，1.5%的琼脂糖胶，上样10ul，跑30分钟，结果显示条带很淡，怎么样才能使条带清晰？请有经验的大虾指点一下，多谢了！

深海寂寞鱼

to sidalin301：$ @: D8 ?7 a0 z* y. {7 N

1 V! \' |7 v# K" j1 z   假设你是用含有EB的琼脂糖凝胶进行的电泳，如果其他操作都没有任何问题的话，
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0 I$ k; }" ~7 ^/ g- Z( W# a; Q" D0 q   那么你最终条带的亮度只和你DNA的量有关，不知道你有没有测过质粒的浓度。/ W& u8 k# d2 G$ X: {
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   你用2ul的质粒进行的酶切（20ul体系），上样10ul，等于你在一个well里上样了1ul质粒。如果你酶切前的质粒浓度大于100ng/ul的话，那么既使对于5mm宽的comb，应该都能看见条带的。
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; ?5 [) B! T' g6 i) W   我觉得你应该从一下几方面分析你实验的问题：
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   1.对你的质粒进行定量，看看浓度和纯度如何。, c6 i4 v# C/ I& Y; H
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   2.根据你定量的结果，重新进行酶切。对于5mm宽的well，上样量控制在100ng/well以上。3 \3 ^2 f7 x3 X5 u( ?- L' P# f

: c/ y' x# e9 H( ]- w6 ~   3.排除EB或者EB浓度的问题。
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   4.你照相的时候有没有试着调整曝光时间，如果你觉得条带很淡，可以在机器上试着调整曝光时间。
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/ g6 O  l' o2 |- E   你可以先试着从以上几方面着手找找原因。根据具体情况再做调整。

sidalin301

回复 2# 深海寂寞鱼
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) _/ x' b) g: i" {& t# X    多谢了，真是经验丰富啊，佩服，佩服！

懵懂干细胞

顶一个！应该是浓度的问题！

chleiwu

可以加大上样量，也可以加大PCR循环数

hljzyydx

上面这个人没事吧，这是要疯啊9 P) S$ Z) G% l4 a
对于这种情况一般两个原因：如果你电泳条件选择没有问题的话可能是质粒浓度比较低，你可以尝试把质粒转化到工程菌种，重新挑取单克隆，这样再次摇菌，重新提取质粒，虽然麻烦，但是浓度可能会高一些！当然如果你原始菌液有很多就没必要这样

sidalin301

多谢各位热心人的帮助，我找到了问题的原因。
7 z' U  q& T: O4 O" N( v我以前以为酶切体系里面质粒的量不能超过体系的十分之一，后来发现自己弄错了，是限制酶的量不能超过体系的十分之一，这样的话可以在体系里面多加一些质粒，问题就迎刃而解了。
3 t9 G3 w5 P7 _. z# r不过还有一个问题请教各位，摇菌的时候能不能挑多个克隆？为什么要挑单克隆？反正质粒都不会发生突变的，大肠杆菌变不变无所谓吧？

绿雪

回复 7# sidalin301
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3 b' s# V9 V0 t; c0 }    能多挑几个，但是要分别扩大，毕竟有太多不确定的因素呀。如果像你说的，质粒不会改变，那你为什么要多挑几个呢？

sidalin301

回复 8# 绿雪
9 h2 g' ^, m( m, a2 W6 M5 i2 Y3 Y' p' e( f4 S" K& a
多挑几个是为了扩增的更快，这样做不科学吗？难道一定要分开扩增？

绿雪

回复 9# sidalin301 3 t" ]: o; H8 u" P  x+ g5 I8 o

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* l2 R/ N# u+ ?0 ?! N    大肠杆菌长得很快的，完全没必要这么做的。挑了单克隆到500ul培养基里面，摇两三个小时就可以见到浑浊了，再按1:1000接种到新的培养基里面，摇过夜，绝对足够你抽质粒的。如果你急着要抽质粒，那么也可以把这500ul全部接种到新的培养基，很快就可以达到所需菌体量了，就不用摇过夜了。
3 r6 m* D0 U$ I" h5 W$ b3 K关于为什么要挑单克隆，这是很好理解的：一个板上长出来的东西不一定都是一样的，在实验过程中很多因素会影响到结果，特别是做连接产物的转化。当然，如果你是用抽提出来的质粒做转化，这种差异相对要小很多。
5 h( _6 K4 t: w/ D呵呵，做实验不要太急躁，多不了几个钟的。如果不够严谨，出了不正常的结果就不知该怎么解释了，也不好解决问题呀。