求助小鼠骨髓间充质干细胞几个问题（附图）

feifei105

# K0 D3 e4 i- K7 s- y  D& s7 F" u4 s, V7 k9 G9 @" C
本人采用全骨髓贴壁法分离3只小鼠胫骨和股骨，用1ml注射器吸取L-DMEM 10%FBS培养基将骨髓冲洗出来，还用血管钳夹碎骨骺端，1000rpm 5分钟后至12孔板2个孔。3天后首次全量换液，至第5天仍不见贴壁变形的细胞，可能的原因？1. 我由于手法问题，将骨髓冲出时发现有些已凝结，但又尽量将血状絮状物冲碎，我园子里有人这么做也分到好些细胞，不知道这个是不是关键？2. 由于培养液的原因导致细胞贴壁不好（我用的进口血清）？
. I% {( U+ }( d8 z' P6 F下面图是第五天的细胞，没有贴壁变形的细胞，请教这些大的圆形细胞（不是血细胞）是什么细胞，我刚取分完时在显微镜下看也都是这种细胞（除了血细胞），只是密度很大而已，所以请各位高手帮帮忙，急死了。
8 Q$ p7 ~5 T/ i6 {. X& Z2 M. x/ l/ n* b0 X6 H8 _4 l* f8 i
还有一问题想请教：我只追求细胞纯度，想采用Percoll是用1.073g/ml吗？我看有人用1.082g/ml,哪个更好，密度梯度离心适合分离小鼠BMSC吗？用全骨髓培养的BMSC纯度如何？
- u( W1 P# x( Z% v& Y0 \3 V  t# ^( L

飞翔的十字架

3天后全量换液有点晚，血细胞虽然不贴壁，但是会沉降
# }2 r5 o5 I1 V我觉得最晚24小时换液

飞翔的十字架

我最近大鼠MSC养的也不好，不管percoll还是全骨髓
0 L: {. ]8 W0 F  {7 {现在正在尝试protocol说的3h换液 以后8h换液直到3d
3 G2 v2 d) X2 e# i. \+ q8 Y3 ?理论上说 贴壁细胞2h肯定能贴壁啦 不过换液要很小心* q4 ~- }) M, t
下午再尝试下离心的 我用的大鼠是1.073

suning

首先，细胞没吹打散。仍有些许细胞聚集。若有血细胞建议裂解，用无菌水几秒即可。大园细胞可能是一些粒细胞吧

daviddow

你用DF12代替那个L-DMEM试试。
+ }/ I0 G6 R# W- E2 y7 W3 N# @血清换成2%。

267318024

我同学用全骨髓培养法养老鼠的BMSCs养的很好呢，24小时半定量换液，然后隔天换液，用PBS液冲洗，细胞培养出来，都开始传代了，你用淋巴细胞分离液，个人觉得不好，干细胞数量本来就少，还分离了再取，又会损失一部分了，并且培养的环境也破坏了。

feifei105

回复 5# daviddow 5 B  P3 s1 ?3 f/ f; G; L$ v

  p% {( @% P. y0 `4 m' W' R- ]; B+ d/ V  U; z' E# a
    2%血清可以吗？不会由于营养不够长得不好吗？

feifei105

我觉得这些大的细胞是中性粒细胞之类的，随着换液就都换走了，可为啥没有我的骨髓干呢？是不是有些凝血的原因？

feifei105

回复 2# 飞翔的十字架
! h& `' J- _" @& y7 @" [4 ~, C5 ~8 r" S

7 }/ b0 o' }! H* \3 c    谢谢，我试试

feifei105

回复 6# 267318024
( A* l  A- }& q9 c( U
9 o( s. N/ Q; D2 g9 [6 J" z0 G0 I! e$ @  h9 z8 c
    非常感谢，可是我没有贴壁的细胞，是什么原因呢？血凝的原因？