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求助小鼠骨髓间充质干细胞几个问题(附图)   [复制链接]

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楼主
发表于 2010-11-12 10:51 |只看该作者 |倒序浏览 |打印
本帖最后由 细胞海洋 于 2010-11-12 10:57 编辑
, I) [# D6 }9 j5 }3 L  i% _) V8 h, o* O
本人采用全骨髓贴壁法分离3只小鼠胫骨和股骨,用1ml注射器吸取L-DMEM 10%FBS培养基将骨髓冲洗出来,还用血管钳夹碎骨骺端,1000rpm 5分钟后至12孔板2个孔。3天后首次全量换液,至第5天仍不见贴壁变形的细胞,可能的原因?1. 我由于手法问题,将骨髓冲出时发现有些已凝结,但又尽量将血状絮状物冲碎,我园子里有人这么做也分到好些细胞,不知道这个是不是关键?2. 由于培养液的原因导致细胞贴壁不好(我用的进口血清)?, a  e) A1 a* X) a# h' k; z
下面图是第五天的细胞,没有贴壁变形的细胞,请教这些大的圆形细胞(不是血细胞)是什么细胞,我刚取分完时在显微镜下看也都是这种细胞(除了血细胞),只是密度很大而已,所以请各位高手帮帮忙,急死了。4 J  t% x" e: }# ~

9 E2 @- x) l6 C0 S4 Y3 I( g还有一问题想请教:我只追求细胞纯度,想采用Percoll是用1.073g/ml吗?我看有人用1.082g/ml,哪个更好,密度梯度离心适合分离小鼠BMSC吗?用全骨髓培养的BMSC纯度如何?
3 G  j3 g7 d7 c' K2 Z8 a0 |  g( M
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沙发
发表于 2010-11-12 13:57 |只看该作者
3天后全量换液有点晚,血细胞虽然不贴壁,但是会沉降
  U- V6 {( o! b" k4 R$ P我觉得最晚24小时换液
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藤椅
发表于 2010-11-12 13:59 |只看该作者
我最近大鼠MSC养的也不好,不管percoll还是全骨髓! x  L: d+ d* _) q8 U0 j" n  V
现在正在尝试protocol说的3h换液 以后8h换液直到3d
9 @' z$ [' f4 O! j5 }) h4 d+ w3 [理论上说 贴壁细胞2h肯定能贴壁啦 不过换液要很小心
3 P; x# m2 j) U9 |下午再尝试下离心的 我用的大鼠是1.073
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板凳
发表于 2010-11-12 16:16 |只看该作者
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首先,细胞没吹打散。仍有些许细胞聚集。若有血细胞建议裂解,用无菌水几秒即可。大园细胞可能是一些粒细胞吧
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报纸
发表于 2010-11-12 18:05 |只看该作者
你用DF12代替那个L-DMEM试试。
8 [; b) U& A# H: B( U: C血清换成2%。
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发表于 2010-11-12 18:30 |只看该作者
我同学用全骨髓培养法养老鼠的BMSCs养的很好呢,24小时半定量换液,然后隔天换液,用PBS液冲洗,细胞培养出来,都开始传代了,你用淋巴细胞分离液,个人觉得不好,干细胞数量本来就少,还分离了再取,又会损失一部分了,并且培养的环境也破坏了。
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发表于 2010-11-12 19:24 |只看该作者
回复 5# daviddow
2 p+ t# ?% [4 P4 c/ q+ R$ a7 D; R* y* C+ ]3 b4 W* e2 k7 k7 w

+ a+ Z4 D5 F+ C    2%血清可以吗?不会由于营养不够长得不好吗?

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发表于 2010-11-12 19:25 |只看该作者
我觉得这些大的细胞是中性粒细胞之类的,随着换液就都换走了,可为啥没有我的骨髓干呢?是不是有些凝血的原因?
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发表于 2010-11-12 19:31 |只看该作者
回复 2# 飞翔的十字架 ) d& d$ X2 X' K! |! F: b
$ U+ e) F5 L: u. s& V1 B% x5 ]5 p
& U. i8 ^) D  `
    谢谢,我试试

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发表于 2010-11-12 19:32 |只看该作者
回复 6# 267318024 0 Q6 G) Y$ w0 v8 c6 M
+ `9 u( j% @- A5 h
' ?  V" W) h+ ~
    非常感谢,可是我没有贴壁的细胞,是什么原因呢?血凝的原因?
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