求助小鼠骨髓间充质干细胞几个问题（附图）

feifei105

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本人采用全骨髓贴壁法分离3只小鼠胫骨和股骨，用1ml注射器吸取L-DMEM 10%FBS培养基将骨髓冲洗出来，还用血管钳夹碎骨骺端，1000rpm 5分钟后至12孔板2个孔。3天后首次全量换液，至第5天仍不见贴壁变形的细胞，可能的原因？1. 我由于手法问题，将骨髓冲出时发现有些已凝结，但又尽量将血状絮状物冲碎，我园子里有人这么做也分到好些细胞，不知道这个是不是关键？2. 由于培养液的原因导致细胞贴壁不好（我用的进口血清）？, a  e) A1 a* X) a# h' k; z
下面图是第五天的细胞，没有贴壁变形的细胞，请教这些大的圆形细胞（不是血细胞）是什么细胞，我刚取分完时在显微镜下看也都是这种细胞（除了血细胞），只是密度很大而已，所以请各位高手帮帮忙，急死了。4 J  t% x" e: }# ~

9 E2 @- x) l6 C0 S4 Y3 I( g还有一问题想请教：我只追求细胞纯度，想采用Percoll是用1.073g/ml吗？我看有人用1.082g/ml,哪个更好，密度梯度离心适合分离小鼠BMSC吗？用全骨髓培养的BMSC纯度如何？
3 G  j3 g7 d7 c' K2 Z8 a0 |  g( M

飞翔的十字架

3天后全量换液有点晚，血细胞虽然不贴壁，但是会沉降
  U- V6 {( o! b" k4 R$ P我觉得最晚24小时换液

飞翔的十字架

我最近大鼠MSC养的也不好，不管percoll还是全骨髓! x  L: d+ d* _) q8 U0 j" n  V
现在正在尝试protocol说的3h换液 以后8h换液直到3d
9 @' z$ [' f4 O! j5 }) h4 d+ w3 [理论上说 贴壁细胞2h肯定能贴壁啦 不过换液要很小心
3 P; x# m2 j) U9 |下午再尝试下离心的 我用的大鼠是1.073

suning

首先，细胞没吹打散。仍有些许细胞聚集。若有血细胞建议裂解，用无菌水几秒即可。大园细胞可能是一些粒细胞吧

daviddow

你用DF12代替那个L-DMEM试试。
8 [; b) U& A# H: B( U: C血清换成2%。

267318024

我同学用全骨髓培养法养老鼠的BMSCs养的很好呢，24小时半定量换液，然后隔天换液，用PBS液冲洗，细胞培养出来，都开始传代了，你用淋巴细胞分离液，个人觉得不好，干细胞数量本来就少，还分离了再取，又会损失一部分了，并且培养的环境也破坏了。

feifei105

回复 5# daviddow
2 p+ t# ?% [4 P4 c/ q+ R$ a7 D; R* y* C+ ]3 b4 W* e2 k7 k7 w

+ a+ Z4 D5 F+ C    2%血清可以吗？不会由于营养不够长得不好吗？

feifei105

我觉得这些大的细胞是中性粒细胞之类的，随着换液就都换走了，可为啥没有我的骨髓干呢？是不是有些凝血的原因？

feifei105

回复 2# 飞翔的十字架 ) d& d$ X2 X' K! |! F: b
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& U. i8 ^) D  `
    谢谢，我试试

feifei105

回复 6# 267318024 0 Q6 G) Y$ w0 v8 c6 M
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    非常感谢，可是我没有贴壁的细胞，是什么原因呢？血凝的原因？