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求助小鼠骨髓间充质干细胞几个问题(附图)   [复制链接]

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楼主
发表于 2010-11-12 10:51 |只看该作者 |倒序浏览 |打印
本帖最后由 细胞海洋 于 2010-11-12 10:57 编辑
' n8 l3 b6 |: ~0 }9 r- s) b- Y7 P" J& N6 Y+ g
本人采用全骨髓贴壁法分离3只小鼠胫骨和股骨,用1ml注射器吸取L-DMEM 10%FBS培养基将骨髓冲洗出来,还用血管钳夹碎骨骺端,1000rpm 5分钟后至12孔板2个孔。3天后首次全量换液,至第5天仍不见贴壁变形的细胞,可能的原因?1. 我由于手法问题,将骨髓冲出时发现有些已凝结,但又尽量将血状絮状物冲碎,我园子里有人这么做也分到好些细胞,不知道这个是不是关键?2. 由于培养液的原因导致细胞贴壁不好(我用的进口血清)?
6 S' ]( I' M" x9 O9 _下面图是第五天的细胞,没有贴壁变形的细胞,请教这些大的圆形细胞(不是血细胞)是什么细胞,我刚取分完时在显微镜下看也都是这种细胞(除了血细胞),只是密度很大而已,所以请各位高手帮帮忙,急死了。/ Q0 v- H& X0 C; e/ m3 ^

) M4 Y' i% G5 g: Y$ g# m还有一问题想请教:我只追求细胞纯度,想采用Percoll是用1.073g/ml吗?我看有人用1.082g/ml,哪个更好,密度梯度离心适合分离小鼠BMSC吗?用全骨髓培养的BMSC纯度如何?
! h1 \5 g1 O0 ^" i6 r
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沙发
发表于 2010-11-12 13:57 |只看该作者
3天后全量换液有点晚,血细胞虽然不贴壁,但是会沉降
5 _) M2 ~% R& X* j: A5 c我觉得最晚24小时换液
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藤椅
发表于 2010-11-12 13:59 |只看该作者
我最近大鼠MSC养的也不好,不管percoll还是全骨髓; g9 Q9 }7 W: \' K$ C  @7 B$ W8 S
现在正在尝试protocol说的3h换液 以后8h换液直到3d$ Q; p. K5 T8 v& t9 ]
理论上说 贴壁细胞2h肯定能贴壁啦 不过换液要很小心1 S/ L! q" b: [: r- T  V0 g% y9 `4 z6 Q) ~
下午再尝试下离心的 我用的大鼠是1.073
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板凳
发表于 2010-11-12 16:16 |只看该作者
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首先,细胞没吹打散。仍有些许细胞聚集。若有血细胞建议裂解,用无菌水几秒即可。大园细胞可能是一些粒细胞吧
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报纸
发表于 2010-11-12 18:05 |只看该作者
你用DF12代替那个L-DMEM试试。* a  e- D* a' ^6 B- R7 c
血清换成2%。
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发表于 2010-11-12 18:30 |只看该作者
我同学用全骨髓培养法养老鼠的BMSCs养的很好呢,24小时半定量换液,然后隔天换液,用PBS液冲洗,细胞培养出来,都开始传代了,你用淋巴细胞分离液,个人觉得不好,干细胞数量本来就少,还分离了再取,又会损失一部分了,并且培养的环境也破坏了。
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发表于 2010-11-12 19:24 |只看该作者
回复 5# daviddow
; g1 T/ J& \6 p& Q2 A3 q3 L% a1 M
. N, R) X+ u) }+ W* A$ ~
9 W, A5 e5 S) f: _/ ~. B. Y    2%血清可以吗?不会由于营养不够长得不好吗?

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发表于 2010-11-12 19:25 |只看该作者
我觉得这些大的细胞是中性粒细胞之类的,随着换液就都换走了,可为啥没有我的骨髓干呢?是不是有些凝血的原因?
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发表于 2010-11-12 19:31 |只看该作者
回复 2# 飞翔的十字架
/ G/ B: s. M3 D8 b7 w4 b
1 w0 m/ [6 @/ {. `3 x! c- [: N: z4 q* ?$ K( X8 L4 w
    谢谢,我试试

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发表于 2010-11-12 19:32 |只看该作者
回复 6# 267318024
7 j8 z5 E: P2 X' A4 F4 B4 c* `* Z
4 @. F4 L/ |8 [! W2 X5 R
2 H$ H, n' \  p4 U( u9 K4 a* S7 ~; @    非常感谢,可是我没有贴壁的细胞,是什么原因呢?血凝的原因?
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