求助小鼠骨髓间充质干细胞几个问题（附图）

feifei105

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本人采用全骨髓贴壁法分离3只小鼠胫骨和股骨，用1ml注射器吸取L-DMEM 10%FBS培养基将骨髓冲洗出来，还用血管钳夹碎骨骺端，1000rpm 5分钟后至12孔板2个孔。3天后首次全量换液，至第5天仍不见贴壁变形的细胞，可能的原因？1. 我由于手法问题，将骨髓冲出时发现有些已凝结，但又尽量将血状絮状物冲碎，我园子里有人这么做也分到好些细胞，不知道这个是不是关键？2. 由于培养液的原因导致细胞贴壁不好（我用的进口血清）？
6 S' ]( I' M" x9 O9 _下面图是第五天的细胞，没有贴壁变形的细胞，请教这些大的圆形细胞（不是血细胞）是什么细胞，我刚取分完时在显微镜下看也都是这种细胞（除了血细胞），只是密度很大而已，所以请各位高手帮帮忙，急死了。/ Q0 v- H& X0 C; e/ m3 ^

) M4 Y' i% G5 g: Y$ g# m还有一问题想请教：我只追求细胞纯度，想采用Percoll是用1.073g/ml吗？我看有人用1.082g/ml,哪个更好，密度梯度离心适合分离小鼠BMSC吗？用全骨髓培养的BMSC纯度如何？
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飞翔的十字架

3天后全量换液有点晚，血细胞虽然不贴壁，但是会沉降
5 _) M2 ~% R& X* j: A5 c我觉得最晚24小时换液

飞翔的十字架

我最近大鼠MSC养的也不好，不管percoll还是全骨髓; g9 Q9 }7 W: \' K$ C  @7 B$ W8 S
现在正在尝试protocol说的3h换液 以后8h换液直到3d$ Q; p. K5 T8 v& t9 ]
理论上说 贴壁细胞2h肯定能贴壁啦 不过换液要很小心1 S/ L! q" b: [: r- T  V0 g% y9 `4 z6 Q) ~
下午再尝试下离心的 我用的大鼠是1.073

suning

首先，细胞没吹打散。仍有些许细胞聚集。若有血细胞建议裂解，用无菌水几秒即可。大园细胞可能是一些粒细胞吧

daviddow

你用DF12代替那个L-DMEM试试。* a  e- D* a' ^6 B- R7 c
血清换成2%。

267318024

我同学用全骨髓培养法养老鼠的BMSCs养的很好呢，24小时半定量换液，然后隔天换液，用PBS液冲洗，细胞培养出来，都开始传代了，你用淋巴细胞分离液，个人觉得不好，干细胞数量本来就少，还分离了再取，又会损失一部分了，并且培养的环境也破坏了。

feifei105

回复 5# daviddow
; g1 T/ J& \6 p& Q2 A3 q3 L% a1 M
. N, R) X+ u) }+ W* A$ ~
9 W, A5 e5 S) f: _/ ~. B. Y    2%血清可以吗？不会由于营养不够长得不好吗？

feifei105

我觉得这些大的细胞是中性粒细胞之类的，随着换液就都换走了，可为啥没有我的骨髓干呢？是不是有些凝血的原因？

feifei105

回复 2# 飞翔的十字架
/ G/ B: s. M3 D8 b7 w4 b
1 w0 m/ [6 @/ {. `3 x! c- [: N: z4 q* ?$ K( X8 L4 w
    谢谢，我试试

feifei105

回复 6# 267318024
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4 @. F4 L/ |8 [! W2 X5 R
2 H$ H, n' \  p4 U( u9 K4 a* S7 ~; @    非常感谢，可是我没有贴壁的细胞，是什么原因呢？血凝的原因？