染色专题汇总——冀望集大家之力整合现行所有染色剂，从细胞到分子，从配方到原理~

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坛子里总是卧虎藏龙的，第一次搞这种集合贴，希望大家鼎力支持。
2 j( _- z5 N5 E/ `“台盼蓝、瑞氏、茜素红、苏木素、油红、溴酚蓝、HE、碱性磷酸酶、vokosa结节染色、免疫荧光染色、阿尔辛蓝、考马斯亮蓝、ACP染色、AKP染色、Brdu 染色、免疫组化染色、结晶紫……”" X0 `3 v8 F; n: R; @5 V  R
从来没有注意到有这么多的染色剂，自己用到的也是屈指可数，掂量了很久，决心整理出来一份完整资料。' n; k$ y; Z0 h8 g" B; x# a( @
希望大家多给资料和意见~

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http://v.youku.com/v_show/id_XMTc1MDQxMjU2.html，这里有一个台盼蓝的染色操作视频。

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台盼蓝——检测悬浮细胞存活率! ~; I6 _9 q. F2 X
, k) W4 ]+ [' ^
基本性质：台盼蓝（Trypan Blue，也称Direct blue 14），或称台盼兰、锥虫蓝
7 l, S  q' ^# r　　      分子式：C34H24N6O14S4Na4
% I0 \  O- g" L　　      分子量: 960.82   C: W5 \- i! O. f5 T& c+ I! X* o
　　      可溶于水（10mg/ml)。) L, R* a& f/ x0 w7 v  H6 R
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原理：通常认为细胞膜丧失完整性，细胞即可被认为已经死亡。台盼蓝是检测细胞膜完整性最常用的生物染色试剂。健康的正常细胞能够排斥台盼蓝，而细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA 结合，使其着色。严格来说，台盼蓝染色检测的是细胞膜的完整性，这被称为染料排除测试（dye exclusion）。
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# n( k; l* q+ p; G# k4 g步骤：(来自supergama)* `; L! k' m3 J# F' R/ j' Z/ H
1、4%台盼蓝母液：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤，4度保存。使用时。用PBS稀释至0.4%。（也可买Gibco的成品）
4 p+ u6 o# m! `" d2、胰酶消化贴壁细胞，制备单细胞悬液，并作适当稀释。, h& Y7 c. g1 h" e8 H
3、染色：细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液以9:1混合混匀。（终浓度0.04%）
- e1 l1 g8 U4 i9 k- k1 F4、计数：在三分钟内，分别计数活细胞和死细胞。 % l4 n8 }+ B. K; O- ~# ~/ g( S# X! J
5、镜下观察，死细胞被染成明显的蓝色，而活细胞拒染呈无色透明状。
3 }- L, o0 K8 G. I6、统计细胞活力：活细胞率（%）= 活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）×100%
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注意：6 J7 Y$ L- N3 x- K+ m) I( ?, ~
1.台盼蓝染细胞时，时间不宜过长，3分钟以内。否则，部分活细胞也会着色，会干扰计数。& I$ V+ t8 V# [# O0 d2 @, N
2.充分混匀细胞悬液,保证细胞分散良好，呈单细胞。5 O! R0 ?8 r4 P, s+ X
3.细胞计数时：计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。2个以上细胞团按单个细胞计算，细胞团应<10% 。
* g" Q' V& b- t3 l) f4. 凋亡小体也有台盼蓝拒染现象，因此该方法不能用于区分正常细胞与凋亡小体。( A- l# w6 ?+ c
5.台盼蓝有潜在的致癌性，需戴手套操作。$ Y/ k- O" s- M9 I0 c' M
6.细胞数较多时，可先拍照再计数。

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求战友资料支持，求斑竹威望支持

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回复 5# yuhaoze % L3 d1 y/ e& S2 N" J) C

2 r2 }1 J0 A; G% S% P6 q. d' ~/ y$ e9 r* @) g6 v/ y
    仁兄格式有些乱，不过刚好看了一篇用Hoechst33342染色的文献，多谢！

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瑞氏染色液(Wright’s Stain Solution)——细胞形态学染色，实验、临床检验常用
* Y. L7 t" E. S9 W6 q: M  d4 D1 }% ^" d
简介" v5 k% ?. t% D4 D
由碱性染料美蓝(Methylene Blue)和酸性染料伊红(Eosin Y)混合配制而成，也称伊红－美蓝染料。其中美蓝为碱性氯盐，呈色部分为阳离子，阴离子无色；伊红的有色部分为阴离子，阳离子无色，其有色部分为酸性，故习称伊红为酸性染料。
0 Y6 S$ s0 S9 k7 a新配制的瑞氏染液染色效果较差，久置, 因其中的美蓝被氧化而含有天青，美蓝天青与伊红能使细胞核染成紫红色，而多余的美蓝则可以使胞浆染成蓝色。化学作用为主，伴有物理亲和反应。2 T1 h* C$ {5 W

/ @, Z# F$ ^. ~4 [, y4 `9 a染色原理：
7 e# F5 ^3 e: `8 e各种细胞成分化学性质不同，对各种染料的亲和力也不一样。如血红蛋白、嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结合，染粉红色，称为嗜酸性物质；细胞核蛋白、淋巴细胞、嗜碱性粒细胞胞质为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色或蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫红色，称为嗜中性物质。
0 j: w# e7 b' l: B原始红细胞、早幼红细胞胞质、核仁含较多酸性物质，染成较浓厚的蓝色；中幼红细胞既含酸性物质，又含碱性物质，染成红蓝色或灰红色；完全成熟红细胞，酸性物质彻底消失后，染成粉红色。3 R( ?; V1 d0 o$ E) L  Z1 K

4 R/ N9 \: [! \, F. u# EpH的影响（pH6.4～pH6.8）
6 `- j$ r1 J: E' m7 y细胞各种成分均属蛋白质，因蛋白质系两性电解质，所带电荷随溶液pH而定，在偏酸性环境中正电荷增多，易与伊红结合，红细胞和嗜酸性粒细胞染色偏红，细胞核呈淡蓝色或不染色；在偏碱性环境中负电荷增多，易与美蓝结合，所有细胞呈灰蓝色，颗粒呈深暗，嗜酸性颗粒呈暗褐，甚至棕黑色，中性颗粒偏粗，呈紫黑色。
4 [+ g5 p9 K- s% I( V2 g- m
* S1 m/ x/ b" W+ E1 G& K( b瑞氏染液的配制：
9 C8 [, R# p8 o+ W+ T1 Z取瑞氏染料1.0g、甲醇600ml、甘油15ml。
4 N8 K0 ^3 G+ D! g$ W# \' j  lI液：将全部染料放入清洁干燥的乳钵中，先加少量甲醇慢慢地研磨(至少半小时)，以使染料充分溶解，再加一些甲醇混匀，然后将溶解的部分倒入洁净的棕色瓶内，乳钵内剩余的未溶解的染料，再加入少许甲醇细研，如此多次研磨，直至染料全部溶解，甲醇用完为止。再加15ml甘油，密闭保存。这便是配制的。4 n2 w: g) g) ]; d& b/ K; P
（新鲜配制的染液偏碱，染色效果较差，经在室温下贮存一定时间，美蓝逐渐转变为天青后方可使用，这一过程称染料成熟。放置时间愈久，天青愈多，染色效果也就越好。但必须盖严瓶口，以免甲醇挥发或氧化成甲酸。染液中也可加中性甘油3ml，防止甲醇挥发或氧化，同时也可使血细胞染色较清晰）5 U& d, f% k: V) `4 }3 w
II液：又称磷酸盐缓冲液(PH6.4~6.8)，包含磷酸二氢钾0.3g，磷酸氢二钠0.2g、蒸馏水加至1000ml。配好后用磷酸盐溶液校正pH。
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染色步骤
; w* K. P$ C' h" x) q/ ?1. 按常规方法制备血涂片，待血膜干后——
: J/ ^. K1 r6 |+ k1 D7 s* p1 l2. 滴加染液，使覆盖全部血膜，30秒至1分钟后滴加等量的磷酸缓冲液（pH6.4~6.8），轻轻摇动载玻片，使缓冲液和染液混合均匀，此时出现一层灿铜色浮膜(染色)。
  O$ I2 |9 T9 y* I: U) D3. 染色3～5分钟后，用自来水缓慢从玻片一端冲洗(注意勿先倒去染液或直接对血膜冲洗)，凉干后镜检。- ^, K/ ^2 X% ^2 g) E
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染色注意事项
3 Z& v0 L( y* b) K1.血涂片干透后固定（可以考虑使用多聚甲醛），否则细胞在染色过程中容易脱落。 2 c# G. n( d9 j1 u' m9 }1 T3 X$ z8 Q
2.冲洗时应以流水冲洗，不能先倒掉染液，以防染料沉着在血涂片上。冲洗时间不能过久，以防脱色。如血涂片上有染料颗粒沉积，可滴加甲醇，然后立即用流水冲洗。 # R2 H! i0 L! r: h+ b  w! ?
3.染色过淡可以复染，（可以考虑针对性使用其它染料如苏木素）。染色过深可用流水冲洗或浸泡，也可用甲醇脱色。 0 O. S7 e1 _8 Y2 K- ^; k! I5 w
4.稀释染液必须用缓冲液，冲洗用水应近中性，否则可导致细胞染色呈色异常，形态难以识别，甚至错误。

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整理资料很累，大家多给些意见，多一些支持

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多谢yuhaoze、jhu132llh、lipd09@mails几位版友的资料，整理结束后我会把完整版给大家传一份。

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接下来介绍吉姆萨染色，论辈分吉姆萨应该是瑞氏他弟，因为吉姆萨的组成为伊红、天青，瑞氏为依红、美蓝，而天青正是美蓝的氧化产物。1 z; D% M3 g6 r" }
比较让人不解的是，吉姆萨比瑞氏要来的娇弱一些，它的工作液为了防止二氧化碳酸化，需要现用现配。瑞氏却是在瓶中放置时间越久越好用，不知道坛子里的大虾们有没有能够解释为啥美蓝不怕酸化的。

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吉姆萨染色——瑞氏染色他弟
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染液组分" d  @/ V$ H( z' t
吉姆萨染液由天青，伊红组成。9 C# u# i1 w" x. c. A/ U0 y
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染色原理6 h* z- I! s# B. F
嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结合，染粉红色，称为嗜酸性物质；
+ J3 k, W. p- c4 a$ ^细胞核蛋白和淋巴细胞胞浆为酸性，与碱性染料天青结合，染紫蓝色，称为嗜碱性物质；
0 S# c5 p1 R& R  W( m1 J中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫色，称为中性物质。
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染液配制; v  u5 e. C6 c/ _; a
配方一：; \8 F' ^, S8 Z- b" f
1. 取1.5g吉姆萨粉末放入50ml甘油中，置于60℃温箱，约3h后溶解。0 G& ~) q( q- c7 H* j
2. 取出后倒入50ml中性甲醇，即为母液。于棕色瓶中长期保存。
% ~8 E  P; m" w: Z2 ^' v& h7 i3. 母液与0.1mol/L的PBS（pH6.9~7.2）按1:9混合即成工作液。工作液宜现用现配，保存时间不超过48h以免被CO2酸化。& }2 z/ Z; T; |: k8 ^. M
配方二：
# T& |( Z8 }$ ~, ~; G" U9 r1. 吉姆萨干粉1.5g，甘油（分析纯）50ml，甲醇（分析纯）50ml。配时先将Giemsa干粉倒入研钵内，加进少量甘油，仔细研磨约半小时，至无颗粒状为止。
+ v& v* w5 Y+ m2 G5 P2. 把剩余甘油全部倒入研钵内磨匀，然后装入棕色试瓶中，置约60℃温箱中保温2小时，再加入甲醇，混匀后贮存备用。& \  P* g- _1 B! Q* W5 j6 W
3. 同配方一。
1 o3 G, s9 O* [. O& ~0 y2 d配方三：3 H0 J( Y: M  A0 I" ]. s+ A/ {
在没有优良吉姆萨染料时可以采用：天青Ⅱ一曙红盐3.0g, 天青Ⅱ0.8g，甘油250ml，甲醇250ml。配时取天青Ⅱ一曙红盐和天青Ⅱ结晶置于干燥器中充分干燥后倒入研钵中加甘油充分研磨，再加入甘油和甲醇，后续过程同配方二。3 ]  G, |% t3 e

  g* {" j0 ?# ]5 {" O; F1 O5 ~染色程序
' s) N& I+ a4 U. U1．标本用甲醇固定5~10min。8 I* p5 ], y  W6 K. A1 b# r' g5 J+ w
2．吉姆萨染色10~15min——可用染色缸或者染液滴覆于标本。* R, s6 u$ u- J" |
3．自来水冲洗掉红色背景。
3 s/ f& p+ W% U! f/ w% Q0 b5 ~8 B1 J  ~( ]
注意事项( {/ ?* d% E: U5 d- Y1 `2 \+ a
PH对细胞染色有影响。细胞各种成分均含蛋白质，由于蛋白质系两性电解质，所带电荷随溶液PH而定，在偏酸性环境中下在电荷增多，易与伊红结合，染色偏红；在偏碱性环境中负电荷增多，易与美蓝或天青结合，染色偏蓝。因细胞染色对氢离子浓度十分敏感，染色用片必须清洁，无酸碱污染。配制染液必须用优质甲醇，稀释染色必须用缓冲液，冲洗用水应近中性，否则可导致各种细胞染色反应异常。