免疫组化基本步骤

xiaocuicui

免疫组化

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1、载玻片的处理：* R  s, h# Y5 I: o; p: q
抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。为保证试验的正常进行，可选用我公司提供的ZLI-9001 APES、ZLI-9003 HistogripTM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine等几种试剂，对已清洗的载玻片进行处理。具体方法如下：
" W% S0 @1 V4 g" J! ?1.1 APES：现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES中，停留20~30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。) a. C* r6 W6 ~8 I+ a+ v
1.2 HistogripTM：将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogrip液中，停留1~2分钟，然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或60oC烤箱烘烤一小时，装盒备用。  {' j3 y, |/ J
1.3 Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60oC烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。
! o4 S/ x, R% j2 T- q2、常用酶消化：
! _. D2 O5 x4 A" q5 [' q3 C2.1 胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%~0.1%，消化时间为37℃、10~40分钟，主要用于细胞内抗原的显示。, X0 F. `3 p$ s
2.2 胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、30~180分钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如：Laminin（层粘蛋白），Collagen IV（IV型胶原）等。
  Y0 T8 E- r* Q4 }% X  2.3 皂素（Saponin）：一般使用浓度为2~10g/ml的saponin溶液，消化时间为室温孵育30分钟。8 F+ S. w) S0 m" T0 ]) Q! t* v8 I
3、抗原热修复：
) I1 A2 j6 z  t7 f3 w+ }* B   可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）效果最好。请选用我公司提供的ZLI-9064 枸橼酸盐缓冲液（粉剂）配制，取该粉剂一包溶于1000ml的蒸馏水中，混匀，其pH值在6.0  0.1，如因蒸馏水本身造成的pH值偏差，请自行调整。
/ d! Q0 o* C6 y3.1 石蜡切片微波炉抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，3％H2O2处理10分钟，蒸馏水洗2分钟×3。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92℃~98℃之间并持续10~15分钟（注意：无论是使用医用或家用微波炉，请根据具体机型酌情设置条件，务必满足以上步骤中对温度和时间的要求）。取出容器，室温冷却10~20分钟（注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型）。PBS洗，下接免疫组化染色步骤。
  s0 k8 B& ]# @* \3.2 石蜡切片高压抗原修复操作方法：切片脱蜡至水。将1500ml~3000ml的枸橼酸盐缓冲液（工作液）注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时（约加热5~6分钟后），计时1~2分钟，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅盖，取出切片，蒸馏水洗后，PBS洗2分钟×3，下接免疫组化染色步骤。
! X% c3 L: c1 _5 w' ^3 @6 l2 z5 |, h& R8 n* T  3.3 石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸，从小容器的温度到达92℃~98℃起开始计时15~20分钟，然后端离电炉，室温冷却20~30分钟，蒸馏水冲洗，PBS洗，下接免疫组化染色步骤。
/ c  [+ g3 N9 ]) c, C& W/ |9 W4、免疫组化染色步骤：: W2 [% u3 |4 P3 w
  （以美国ZYMED公司SP试剂盒为例）6 b" n+ w" E# W3 I- r: q
   石蜡切片脱蜡至水。. z: t0 P' Q3 }
   3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。: F  x% J2 P# |
   蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，(如需采用抗原修复，可在此步后进行)。
6 L4 J) T- \* C- H   5~10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。
; P' Z9 G, z2 _2 @/ J8 T$ o   PBS冲洗，5分钟×3次。+ a5 l! ]# ^+ q1 }. y5 {
   滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。
* `! T7 o( d+ Y7 S5 |  E( Y   PBS冲洗，5分钟×3次。( F) |1 M( _  v, v4 c
   滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。% I7 @" g/ W: y6 r
   PBS冲洗，5分钟×3次。
: a, L& d* G( f$ g9 a0 V   显色剂显色（DAB或AEC）。. ]" w9 d* J, w0 X5 E) H5 S! R
   自来水充分冲洗，复染，封片。
$ N4 F, I( O; u% w- g8 M冰冻切片免疫组化染色步骤
+ W9 _! H: w5 \2 H7 N冰冻切片4~8m，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3％过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟×2。* C. S) r4 L+ ~3 R) l# c* \: H
下接免疫组化染色操作步骤。

seventhcat

受益匪浅，谢谢

xiaocuicui

真的很有帮助

421087176

谢谢

syl1982

免疫组织化学染色 1 \3 F  r) F+ S' H$ H! [1 G
SP法： 1 s  \1 h+ E2 V. N9 t& F  n
脱蜡、水化： 6 R& g. ]  v/ f4 X% a6 e: A3 e7 F- W0 o
脱蜡前，应将切片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
* z" ~1 _" ]0 T切片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟； 6 w! ?. D) G* u3 {" o# q0 Q/ H
无水乙醇中浸泡5分钟； : w8 ^9 n* z" g! c5 J4 V/ t
95%乙醇中浸泡5分钟； 3 a* g3 u: a% U$ k0 w
70%乙醇中浸泡5分钟；
  q/ M) Z/ d. g2 t4 VPBS洗2～3次各5分钟；   c. I/ p# e% u+ u& e" |4 J
3%H2O2（80%甲醇）滴加在切片上，室温静置10分钟； 7 e. W; J  C5 W3 i" B! c
PBS洗2～3次各5分钟； 8 O7 P( \# I1 m+ v( g3 C% ~
抗原修复：（用于福尔马林固定的石蜡包埋组织切片）
* D2 _4 C5 A1 g2 s% z抗原热修复
! ^- [+ r4 c; z# q6 V高压热修复 在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。 ' E. @' F+ y$ ^) y' S1 P
煮沸热修复 电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入切片加热10~15分钟。 ' V. U' ]  J" k/ p3 [$ d( x
微波热修复 在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将切片放入，断电，间隔5~10分钟，反复1-2次。适用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。
4 B8 X! @( {! x, f. b; z酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至37℃，切片也预热至37℃，消化时间约为5~30分钟；胃蛋白酶消化37℃时间为30分钟。适用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。
; @! z; S( W, C3 FPBS洗2～3次各5分钟；
0 U% g" [+ l0 ~) u" F滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。甩去多余液体。
, e. U; C& A' W. x. x6 U滴加一抗50μl，室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。
" |' |1 B( A, [/ Y- r4℃过夜后需在37℃复温45分钟。 $ Y+ s7 k7 I0 U8 |% T
PBS洗3次各5分钟；
# G4 t3 K) v8 O' o. p; Q( [+ p, \滴加二抗40～50μl，室温静置，或37℃1小时；
. I* a! V# P; P( H) O0 ]. m. z二抗中可加入0.05%的tween-20； 8 O4 p7 n; ^! c" C# E* r; }8 J
PBS洗3次各5分钟； $ F1 g1 p8 J+ ]3 Y9 e
DAB显色5～10分钟，在显微镜下掌握染色程度； % J( L  A1 }3 h# D
PBS或自来水冲洗10分钟；
- E' A5 U. W* j% ^4 s. I) y苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化；
7 Y9 g4 U( Q7 a* U% }0 ^& s# M8 ?自来水冲洗10～15分钟； - J% e/ c" I2 O! O% k5 W
脱水、透明、封片、镜检。 5 ?3 P7 z7 i' V) _/ V
SABC法: * p- p3 C5 W6 P% m0 j
脱蜡、水化； * w) h( G6 o( E
PBS洗两次各5分钟； 4 g, f* v1 `! s5 v6 P5 {6 _
用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭5～10分钟，蒸馏水洗3次；
' x2 \8 M2 o; ]3 n8 @抗原修复；
  x, A" x# m) k6 a' d& |; ?: \PBS洗5分钟；
0 L! _9 M  i8 i) q3 X7 c( c滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体； + c! q; c  o1 O: f$ P
滴加一抗,室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（4℃过夜后在37℃复温45分钟） 4 y  v0 c  f$ K0 f0 x6 M
PBS洗三次每次2分钟；
6 G6 V8 _# @/ q0 _: N滴加生物素化二抗,20℃～37℃20分钟； * T3 c( B/ Y$ Y0 ?; O* g, A  }- a! \
PBC洗3次每次2分钟；
* y# L0 }0 C  j6 k/ y滴加试剂SABC，20℃～37℃20分钟；
, H- B: F' O3 jPBS洗4次每次5分钟； 7 E( s+ Q7 ?% r2 o7 }+ e
DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）； 6 V! `& K& x6 G: w
蒸馏水洗。苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化；   R) e2 {+ R* J: o
脱水、透明、封片、镜检。   o. e4 q' J9 a0 j% B4 G

aulenuyah

谢谢楼主

aulenuyah

和回答的同志们

wstl1986

很有用