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做细胞的免疫组化步骤：
9 J' f" S2 y% A6 x1.片子的制作：可以做细胞爬片，细胞甩片，还有直接在24well/12well/96well中直接染色
3 @9 t* U" z/ L$ c y3 u3 r 细胞爬片的制作：直接购买公司的已经处理过的细胞爬片，要是自己制作的话，就用无菌的盖玻片用多聚赖氨酸处理后让细胞自己爬片
, r' b. c3 A+ u! } 细胞甩片：需要甩片机将细胞悬液均匀甩到玻片上。
7 h+ Z8 ?- s6 w6 p% j 其实小的well的话，可以直接拿来染色，没问题的。3 O3 B n# f- J# U0 W
2.固定：用PBS洗去培养液，用固定液（如甲醇和丙酮；4%多聚甲醛；酒精。。。）固定细胞。
/ t3 o: E( x7 C2 {3.内源性过氧化物酶处理，3%过氧化氢处理细胞（选作，二抗连HRP得必做，其他的如做免疫荧光染色不用做）。1 ?' n: t7 J. t7 {; V$ {
3.通透（胞浆蛋白和细胞核蛋白需要做；细胞膜蛋白不需要做），一般选用Triton-X100来做细胞通透，浓度和时间需要摸索，一般是0.1-5%，处理时间为1-30分钟，级个别需要到1-2小时。
) e6 p, ^+ h& b4.封闭：洗去通透液，用二抗同源的血清约10%的浓度in PBS中封闭半小时，也可以选用5-10%脱脂奶粉。封闭结束后千万不要洗，直接上一抗。5 C9 m2 Y. q: S
5.一抗：具体你想做什么样的蛋白，咨询抗体公司如santa cruze,Abcam,sigma....。选取具体的抗体，但是一抗的稀释浓度也是要摸索，抗体稀释液可以购买抗体公司现成的，对于新手还是挺好的。时间一般是4度过夜或者37度1小时。一抗最好还是选用外国抗体公司的抗体。
, i- Y/ d5 G# R' W; n5 W6.洗去一抗。
4 f' q0 n3 i5 I( |7.上二抗，二抗一般抗体公司会给你推荐的，你在其中选上一个就行了，自己选国产的也行，就是选在哪个动物体内做的一抗，二抗就选抗那个动物的就行了。二抗的浓度也是需要摸索的，抗体稀释液和一抗相同就行了。二抗的时间一般是37度半小时。8 T' [) o4 i4 z& s ~* i
8.底物显色（选作，二抗连得是酶的必做，按试剂盒的说明书添加就行了，显色时间可能需要摸索，以免显色过度引起假阳性；二抗连得是荧光报告的不用做）3 ~/ [* _3 v' @2 L7 W1 }
9.洗去二抗，染核" j: a! d A. n
DAPI或者Hoechst染核
& m& `+ w% r" R$ l% s+ l3 Z9 V10.洗去染核液，加PBS，上镜观察。 |
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发表于 2010-11-24 21:19
发表于 2010-11-25 18:17
