请问大家通过免疫组化检测细胞中marker蛋白时用什么方法？

jhu132llh

做细胞的免疫组化步骤：
! w# |: s& X# @( p; l" ^1.片子的制作：可以做细胞爬片，细胞甩片，还有直接在24well/12well/96well中直接染色+ [# [0 ~3 @9 t( J; O9 O
     细胞爬片的制作：直接购买公司的已经处理过的细胞爬片，要是自己制作的话，就用无菌的盖玻片用多聚赖氨酸处理后让细胞自己爬片
1 Y9 U7 z" ]# ?6 o    细胞甩片：需要甩片机将细胞悬液均匀甩到玻片上。
* l* e" Z) T0 G    其实小的well的话，可以直接拿来染色，没问题的。; r8 c2 u% }  l4 w8 k8 A
2.固定：用PBS洗去培养液，用固定液（如甲醇和丙酮；4%多聚甲醛；酒精。。。）固定细胞。- x7 f& y5 d$ r  N% y) y
3.内源性过氧化物酶处理，3%过氧化氢处理细胞（选作，二抗连HRP得必做，其他的如做免疫荧光染色不用做）。0 p' I/ t1 X+ [# _! w
3.通透（胞浆蛋白和细胞核蛋白需要做；细胞膜蛋白不需要做），一般选用Triton-X100来做细胞通透，浓度和时间需要摸索，一般是0.1-5%，处理时间为1-30分钟，级个别需要到1-2小时。) u- I' ~" @6 z6 i2 ~  g! G9 H# ]7 _
4.封闭：洗去通透液，用二抗同源的血清约10%的浓度in PBS中封闭半小时，也可以选用5-10%脱脂奶粉。封闭结束后千万不要洗，直接上一抗。3 f" C  Q! P% F! E$ H0 r! k& M
5.一抗：具体你想做什么样的蛋白，咨询抗体公司如santa cruze,Abcam,sigma....。选取具体的抗体，但是一抗的稀释浓度也是要摸索，抗体稀释液可以购买抗体公司现成的，对于新手还是挺好的。时间一般是4度过夜或者37度1小时。一抗最好还是选用外国抗体公司的抗体。6 L3 t7 H& v# {
6.洗去一抗。
$ F+ |0 u% N4 H6 l4 ?4 L7.上二抗，二抗一般抗体公司会给你推荐的，你在其中选上一个就行了，自己选国产的也行，就是选在哪个动物体内做的一抗，二抗就选抗那个动物的就行了。二抗的浓度也是需要摸索的，抗体稀释液和一抗相同就行了。二抗的时间一般是37度半小时。0 R, o3 k$ }/ c) w7 m) m" P/ a
8.底物显色（选作，二抗连得是酶的必做，按试剂盒的说明书添加就行了，显色时间可能需要摸索，以免显色过度引起假阳性；二抗连得是荧光报告的不用做）2 Y( E0 I. \  ~, k3 t4 Z
9.洗去二抗，染核* s6 t/ u9 w% ]) y8 O
  DAPI或者Hoechst染核
% \& L! f! m. O5 v' X' x/ V7 A5 h8 E10.洗去染核液，加PBS，上镜观察。

jhu132llh

以上是我个人的实验总结0 @7 j; `1 A' h- b3 l3 @
小弟做免疫组化差不多有两年了. c2 u; [, |  U6 r$ ?
基本上按这个做事没什么的问题的
8 N; ]# u' ]( R! Q9 F关键在于：
5 \" }! U5 d6 U! D$ K1.选取一个合适的抗体，这一点，你咨询抗体公司，尤其是国外的抗体公司，一般他会给你一个满意答案的。
( D7 `7 I1 D8 d. v; w0 R7 \1 ~/ X2.在于固定液的选择，具体的细胞可能对固定液会有点选择，摸索一下就可以。
/ ]4 ^/ B8 C3 d! D3.在于通透火候的掌握，这个在于反复摸索。
0 T, P5 g2 G/ s: [) T7 S4.一抗的稀释浓度，这个尤其需要反复摸索，以其避免假阳性出现9 c1 N) w4 c# X/ D' Z2 G
5.照相技巧，照出一张好张片是需要好的技巧的。

jhu132llh

单染是指只染一个抗体
8 j( J4 L3 W4 g7 C0 u' U双染是指在同一个样品上染两个抗体，即染完一个后继续染第二个
" |1 R' g/ Y7 F- l3 c双染一般是用来通过双染让某些细胞同时染上两种不同的荧光而达到证明这个细胞具有某种两个抗体都能证明的特性，或者证明其中一种抗体也具有另外一种抗体的特性，这种染色法得出的结论更具说明性和科学性4 Q3 j7 G8 P4 |. I
双染的话是要考虑下双染的封闭血清