求助：干细胞传代后逐渐死亡，望高手帮忙指点啊！！

stefan

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- U. b, Q1 c2 v$ V9 v9 d! V做骨髓间充质干细胞培养已经快3个月了，一直不顺利啊，前一段时间不是养不出来就是遇到污染的问题，现在养出来了吧，传代后细胞逐渐死亡，不知道是什么原因，我自己感觉可能是由于自己传代时胰酶量有点大，对细胞损伤太大所造成的。下面是我的操作，请大家给点建议！！
% n) ?. _/ |) v4 \     原代细胞培养10天左右，待细胞铺满瓶底70%左右传递一代细胞。1：1传代（由于细胞呈团簇聚集，有的地方细胞多有的从地方细胞少，所以我没等到80-90%时传代，直接到70%左右就传代了，这点不知道传代时机对不对，大家给点建议！）传代后3天后首次换液，以后3天左右换液，直到细胞铺满瓶底80%左右传第二代，第二代按1：2传代，然后又是3天左右换液，如此重复。当我传到第二代细胞后，细胞逐渐死亡，每次换液前可见有细胞漂浮，换液后细胞量就逐渐减少。我用的胰酶浓度是0.25%+EDTA，Hyclone 的，都是在常温下消化，每次消化1-2分钟，当我每次加完胰酶后直接到镜下观察，即可可见细胞已经变圆，然后立即用含10%胎牛血清的培养基终止消化，然后拍打瓶体，直到细胞漂浮起来，然后1000转离心5分钟离心2次，然后吹打细胞接种到培养瓶中，以后每3天左右换液。( V. I/ Q- ^3 @
   不知道我以上的操作对不对，我感觉是不是胰酶浓度过大造成细胞损伤太大，请各位指点！！下面是我细胞的照片：% W2 p+ r: Y) W9 Q: O! a$ H' w
   1原代细胞图片，传代前细胞分布不均匀8 C) ~2 f' a8 U+ s; b5 S' r2 _4 e2 j

* w* V2 [$ I8 T9 ~) Y/ m& Z2 i' [
5 a1 ]8 Q7 s7 V/ r/ t3 ]  h3 ^" L2第一代细胞4 L7 I# [2 g) S, g$ ~8 [9 C$ J4 j
[img]
: N3 m  C% t4 h0 _3 Q' ~第一代细胞传代前细胞情况，我是以这个密度传代的， 不知道合不合适！细胞形态也发生了改变！2 d* r- x! y4 U2 }1 [# j

) ~1 v5 i9 D. y* t: q! [
; w+ b3 s& P% z2 r8 Q- T4 [这张是高倍镜下的图片！细胞形态和原代有差别，不知道有没有老化的趋势！！4 W, n1 g+ C' w) P" x4 r' K
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! X' U2 t4 s7 l- N2 m
) a) [# g, s. O3第二代细胞( ~. a. C) L. I
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1 U; k0 y* x5 S第一代细胞传代后3天的照片，细胞就逐渐死掉了！
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; s. L( M9 e2 _6 m: Y8 a高倍镜下图片！) ?" b$ [4 |5 i
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飞翔的十字架

P1形态就不对了% [* I' [. {# W/ g! F
感觉分化了的可能性很大

get0715

1、原代生长一般不会均匀，只要有几处局部长势很好就可以传了，一传一没问题。
/ o8 V+ y' @% [+ U9 p& D  I2、传代的时候可以不用带EDTA的胰酶，而且可以离心一次就够了，离心对细胞的损伤还是很大的。: E  r( T8 J; z. D3 t- l2 ]% w
3、传代后的细胞形态已经不再是MSC了，像是分化了。改进传代方法之后如果还是这样的状况，可能就要改进培养基的成分了。

tjutiger

1.传代用0.05%的胰酶，0.25%是消化肿瘤细胞用的，浓度有点太大了，MSC还是比较娇气的~~浓度过大会造成MSC过早衰老。2 P5 |4 C3 Q7 S$ f
2.离心不用两次，甚至不用离心，直接吹散，1:3传就行。
- S" a: S# q9 \3.传代密度很重要，一般密度过稀，细胞不容易长起来，MSC貌似有细胞间的接触会长的更好。
, \, |% C9 B- }& c6 K! x  V. p4.每次都最好换到新瓶里，长过MSC的旧瓶最好不要再继续培养了。这个个人感觉很重要！！
( o3 h# f$ b  P5 S( X; |个人一点小经验。。。祝LZ顺利。望版主加分！！

流云阿凯

我跟你操作的不同在于：
# a6 H& S& L5 K( {" |+ O1、胰酶消化最好放在37度培养箱内消化，这样可以保证胰酶的最佳活性
2 y2 Z2 d' D- [, z/ ?7 ?2、终止消化用的所加胰酶量的20%，而不是用含10%血清的培养基4 O, F" _* w& E4 O
3、终止后，我是用吸管轻轻吹打培养瓶的底部把细胞吹下，形成细胞悬液
/ J" e3 f0 O; t. l$ J# }5 f8 d4、离心转速1200r/min离心8分钟左右即可，不用离两次4 o( _. F7 K. U! w8 L6 F- W! L2 E
还有就是感觉你第一代的细胞应该是不纯的，有杂细胞，还有就是传代的时机把握的不是很好吧！看着细胞还没怎么长开呢！
* i5 ]1 }+ v& B  `6 K6 t以上意见仅供参考！

皮搋子

可能存在的问题：
, x# c9 l6 b1 |" q" S0 i( Q  h- S1、胰酶浓度过高，我们用0.05%胰酶，这样细胞消化速度不会很快，你可以在镜下观看消化程度，待细胞圆缩可轻晃培养液看是否可漂起，只要见有漂起就立刻终止。
4 X% m$ M6 U  P4 @& P! E$ k2、离心一次即可，1200-1500rpm，离心5min，离心时间长对细胞也有很大损伤。
2 ^+ ?( Q  O9 r3 f" i1 d: W3、从图/2上看，你的传代时间有点晚，传代时间过晚会导致细胞分化，你的细胞看来已经分化了。如果细胞分布不均，只要局部细胞长到细胞触角相连又不是很密即可传代，如果细胞量少可以一传一。细胞量多可以1传2或1传3。6 m1 s, ]: x! f3 x7 q( t1 m
4、细胞终止消化后用吸管轻轻吹打下来较好，拍打容易使瓶口留有太多培养液，易污染。* g/ r0 U5 ~* l2 J3 Q
5、每次传代用新瓶较好，我们一直用corning的瓶子，贴壁较好。' w2 ~/ |7 d- b  `$ Z* N) u4 P/ s
6、培养液是否已偏碱，培养液的pH对细胞生长有较大的影响。
/ H7 B; h% k1 m7 @, ~希望对你的实验有帮助。祝实验顺利！！

stefan

谢谢各位的指点，收获颇多，改进传代方法和传代时间后再看看情况，准备把胰酶浓度改为0.05%试试，然后就是传代时间准备提前看看。有好的结果后再来报告！还有就是细胞老化是一直困扰我的问题，看论坛中的同道也遇到同样的问题，不知道各位能有什么建议尽量减少细胞老化啊？望指点！！

luoye1986

我提一点，在终止消化时使用5%的血清，血清浓度过高势必会影响细胞的状态，尽管接触的时间不是很长。而且要尽量减少传代，传代周期要适当的放长点，要让细胞有一定的适应期和生长期。

静水流深

我的细胞也有此种情况 难过啊 感觉像是细胞凋亡了