人骨髓间充质干细胞对异体外周血T淋巴细胞的抑制作用及机制 - 国内文献区干细胞之家



免疫细胞治疗专区	欢迎关注干细胞微信公众号

12 3 4 5 6 7 8 9 10 ... 32 下一页

返回列表

查看: 819410\|回复: 313	go 人骨髓间充质干细胞对异体外周血T淋巴细胞的抑制作用及机制 [复制链接]

文献管理员

版主

Rank: 7 Rank: 7 Rank: 7

积分: 8
威望: 8
包包: 898

楼主

发表于 2009-3-3 12:35 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：白海，司志刚，王存邦，薛智文，吴涛，杨小亮作者单位：(兰州军区兰州总医院血液科，全军血液病中心，甘肃兰州 730050)





                  . n" _; e$ i8 @. l3 D+ h
         1 K% `1 n/ V. j9 x' T3 s

                  # j3 Q% P% R9 _1 C$ b  o& L( ]$ a4 p


      ' ^5 p) u" i1 n; u7 K8 l


      【摘要】  目的：探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）体外对异体外周血T淋巴细胞的抑制作用及机制. 方法：从骨髓中分离培养MSCs，反复贴壁进行纯化；用尼龙棉柱法纯化异体外周血T淋巴细胞；观察MSCs对植物血凝素（PHA）刺激下T淋巴细胞增殖的影响，用ELISA方法检测IFNγ，IL4水平变化. 结果：  MSCs对PHA诱导的T淋巴细胞增殖有抑制作用，并呈剂量依赖性；同时MSCs亦可抑制T淋巴细胞的IFNγ分泌，但可促进IL4的分泌. 结论： MSCs对异体外周血T淋巴细胞的增殖有抑制作用，其作用可能与其影响T淋巴细胞分泌IFNγ和IL4有关. 3 d/ Q0 Q1 n  ?* N2 {2 W* ~
      【关键词】骨髓间充质干细胞；T淋巴细胞；免疫调节；干扰素γ；白细胞介素4
   0引言5 o. C% i; d- T6 q+ W0 \" C
8 ^1 K7 p( S- J& w! L% S1 Q/ q
骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是骨髓中不同于造血干细胞的另一类成体干细胞，这类细胞易于采集、分离和体外扩增，除具有高度增殖及多向分化潜能、促进机体造血重建外，还具有抑制同种异体免疫反应、减轻移植排斥等免疫调节作用，但具体机制还不清楚. 为进一步探讨MSCs的免疫调节功能，我们研究了MSCs对T淋巴细胞增殖及其分泌IFNγ与IL4的影响.4 w. P/ {* V' ?6 o$ {! f3 e5 t
$ |3 [9 ^& @, R$ E# |
1材料和方法
& {# Y" w/ H( V# {8 L
1.1骨髓MSCs的分离、培养与鉴定抽取肝素抗凝的健康供者骨髓20 mL（n=10），DMEM（Gibco）倍比稀释，Ficoll分离液（天津灏洋）2000 r/min,15 min条件下分离出单个核细胞，DMEM洗涤2次，完全培养基（100 g/L胎牛血清  DMEM）重悬细胞，以2109/L接种于25 cm2培养瓶内，37℃，50 mL/L CO2孵箱内培养，24 h首次换液，以后每2～3 d换液1次，细胞融合度达80%时消化传代培养，流式细胞仪分析检测传至3代MSCs的纯度.' o0 B# T. A% ]4 _' P

1.2外周血T淋巴细胞的分离与纯度鉴定取新鲜肝素抗凝人外周血20 mL，Ficoll分离液（2000 r/min,15 min）分离出单个核细胞，尼龙棉柱法进一步分选T淋巴细胞，流式细胞仪分析尼龙棉柱分离前后T淋巴细胞的纯度.: e# f9 k4 n, v- k! T
/ Z7 O5 ~9 M: ?! D
1.3MSCs对植物血凝素（phytohemagglutinin, PHA）作用下的T淋巴细胞增殖的影响取第3代培养的MSCs，经60Co照射30 Gy，调整细胞密度，按细胞数分为3组，A组1103个，B组1104个，C组1105个，每组设单独同等数量MSCs为空白对照，以单独T淋巴细胞培养为阳性对照. 以终体积100 μL／孔，加入96孔培养板内，MSCs完全贴壁后吸去上清或更换培养液，并除空白对照外各组加入T淋巴细胞1104/孔. 经PHA 5 μg（Sigma）作用68 h后加入20 μL／孔MTT（Sigma）继续孵育4 h，弃上清后二甲基亚砜固定，酶标仪490 nm处测定A值，增殖百分率=（实验组A值-对照组A值）/实验组A值.

1.4MSCs对PHA刺激下的T淋巴细胞IFNγ，IL4分泌的影响分别用1107/L，1108/L MSCs与1109/L的T淋巴细胞共培养，同时加入5 μg 的PHA. 应用IFNγ，IL4试剂盒（武汉博士德）检测各组培养上清中IFNγ和IL4浓度.. ]9 ^6 ]* f+ |7 T, ?  y4 V

统计学处理：应用SPSS软件进行统计分析，实验结果用x±s表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用Dunnettt检验，P
, U' T, i' x" |8 }3 o7 V- ^
2结果9 h, \& O' l0 `3 v

2.1MSCs与T淋巴细胞纯度鉴定原代MSCs形态均匀一致，呈长梭形，流式细胞仪结果显示：传至3代MSCs高表达CD29，CD44和CD13，而CD34，CD45，HLADR低或极低表达，纯度达90%以上；异体外周血单个核细胞经尼龙棉柱分离后CD3 细胞百分比达98%以上." {2 j; {7 p' B: ^

2.2MSCs抑制T淋巴细胞的增殖MSCs对PHA刺激下的T淋巴细胞增殖呈抑制效应，并呈剂量依赖性. 单纯RPMI1640培养基条件下，T淋巴细胞阳性对照组的增殖率为（77.05±1.94）%，A，B，C组依次为（44.94±5.84）%，（33.45±7.00）%，（17.64±4.59）%，与阳性对照组比较均有统计学差异（P+ C6 v- \) I( ^: ]% t: s
# O$ |, ?5 l+ ]: O7 ?/ ?- G& Z8 u# L
2.3MSCs抑制T淋巴细胞IFNγ的分泌在单纯培养条件下，T淋巴细胞在PHA刺激下其上清分泌IFNγ为（79.16±13.40）ng/L，与1107/L，1108/L的MSCs共培养时IFNγ的分泌分别为（25.54±7.05），（9.55±3.60）ng/L，IFNγ分泌明显减少（P

2.4MSCs促进T淋巴细胞IL4的分泌在单纯培养条件下，T淋巴细胞在PHA刺激下其上清分泌IL4的量为（46.04±9.67）ng/L，加入1107/L，1108/L MSCs后，IL4的分泌增加，分别为（67.10±11.44），（97.92±19.48）ng/L，与单纯T淋巴细胞培养组比较差异具有统计学意义（P4 K' `' |% F8 F
& v: O# u' v7 ~. b
3讨论$ Z" H% e% q) M3 G+ N8 ^
7 s, p  c) G  d! H( i
MSCs是骨髓中的一类成体干细胞，是造血微环境的主要细胞成分，能分泌多种细胞因子，在维持造血微环境的稳定中起重要作用［1］. 在特定条件下具有向脂肪细胞、成纤维细胞、成骨细胞等多系分化的能力［2］. 目前研究发现，骨髓MSCs还具有免疫负调节和降低移植物抗宿主疾病(graftversushost disease, GVHD)的作用［3-4］. 小鼠的移植实验及临床的I，II期研究均发现，骨髓MSCs与造血干细胞共输注可以降低异基因造血干细胞植入引起的GVHD. Bartholomew等［5］将体外扩增的供者MSCs输注给行皮肤移植的狒狒体内，结果是皮肤移植物被排斥时间明显延长,提示MSCs具有免疫负调节能力. 并且骨髓MSCs低表达或不表达MHC II(HLADR), B7, CD40和CD40L，说明MSCs可能不具免疫原性，自身不引起T细胞的识别而产生免疫排斥［3］，为进一步临床应用提供了可能.

我们的实验结果亦表明MSCs能抑制PHA诱导的异体T淋巴细胞的增殖反应，并且其抑制作用与MSCs的细胞数量有关，呈细胞数量依赖性，与报道一致［3］. MSCs对T淋巴细胞增殖抑制作用的机制尚不清楚. 有学者指出，MSCs发挥免疫抑制效应无需抗原递呈细胞或CD4 CD25 调节性T细胞参与［6］，提示细胞间的直接接触是MSCs发挥抑制效应的重要环节；MSCs在体外培养条件下能分泌多种可溶性细胞因子，如TGFβ，HGF，可能是介导MSCs免疫调节作用的重要因子［7］，为了解MSCs对T淋巴细胞分泌细胞因子的影响，我们检测了MSCs作用下T细胞培养上清中IFNγ和IL4的变化，结果表明MSCs可抑制T淋巴细胞IFNγ的分泌，而促进IL4的分泌，并且在本检测条件下，MSCs对这二类细胞因子的影响具有一定的MSCs细胞浓度依赖性. 已知IFNγ是Thl细胞免疫正调节因子，而IL4主要由Th2细胞分泌的细胞因子. 结果说明MSCs可能以抑制Thl, 增强Th2的功能为主. 在异基因造血干细胞移植后GVHD发生的病理生理过程中，除了直接由T细胞介导的细胞毒作用外，大量的炎性细胞因子如白细胞介素(IL)，肿瘤坏死因子(TNF)，干扰素(IFN)等参与了GVHD的发生发展. 特别是在急性GVHD中，IFNγ是关键调节因子，在促使单核巨噬细胞产生大量IL1和TNFα中起重要作用［8］，因此，T细胞分泌IFNγ的减低，可以消减GVHD发生发展中免疫应答和“细胞因子风暴”的恶性循环，降低GVHD发生. 有证据表明，IL12，IL4对Thl和Th2细胞的分化启动和进一步发展起着主要作用［9］. Th2细胞分化的最主要决定因素是IL4. 此外，IL4对Th2细胞的增殖、基因转录以及抗凋亡也起着十分重要的作用，从而可减低GVHD和移植物排斥的发生. 所以MSCs体外抑制T细胞增殖并减少T细胞IFNγ的分泌, 增加IL4的分泌,可能是MSCs体内预防和减轻GVHD的机制.
      【参考文献】
［1］江逊，崔鹏程，陈文弦，等．人骨髓间充质干细胞体外培养及生物特性的观察［J］．第四军医大学学报，2003, 24(4):351-353.
% |2 n7 f2 A% S  c% z5 F2 G" j

［2］ Horwitz EM. MSC: A coming of age in regenerative medicine［J］. Cytotherapy, 2006, 8(3): 194-195.

/ Y3 _1 P& K* j% u

［3］ Klyushnenkova E, Mosca JD, Zernetkina V. T cell responses to allogeneic human mesenchymal stem cells: Immunogenicity, tolerance, and suppression［J］. J Biomed Sci, 2005, 12(1): 47-57.

7 G0 l7 T3 ^6 s# d1 T$ x0 I- h( j
; U' Y( D4 |# ~, j8 Z
［4］吴涛，白海，王存邦，等．成人骨髓间充质干细胞抑制异体淋巴细胞增殖的实验研究［J］．中华微生物学和免疫学杂志，2006, 27(2):111-113.
# P: Y- V. Y8 k' [) z1 j1 e
! E" ]6 k# L. z4 p0 n* N, ~6 l$ @

［5］ Bartholomew A, Sturgeon C, Siatskas M, et al. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo［J］. Exp Hematol, 2002, 30(1): 42-48.
/ o# |! s6 v% l, g
+ X1 c! ]3 @. o

［6］  Krampers M, Glennie S, Dyson J, et al. Bone marrow mesenchymal stem cells inhibit the response of native and memory antigenspecific T cells to their congnate peptide［J］. Blood, 2003, 101(9): 3722-3729.
% s& I. x' g- {' d

［7］ Tse WT，Pendleton JD，Beyer WM，et al．Suppression of allogeneic Tcell proliferation by human marrow stromal cells：Implications in transplantation［J］. Transplantation, 2003, 75(3): 389-397.; N9 f( P$ _7 r% @& b
7 s& f4 |+ C; F" n- ?$ q( Y, g( @8 x
  o4 w* {  q) {* a4 F, {

［8］ Reddy P. Pathophysiology of acute graftversushost disease［J］. Hematol Oncol, 2003, 21(4):149-161.

  |1 a/ O9 Y% c. D  u* B
) t1 X+ J# L9 D+ S0 G
［9］ Kamogawa Y, Minasi LA, Carding SR. The relationship of IL4 and IFN gammaproducing T cells studied by lineage ablation of IL4producing cells［J］. Cell, 1993, 75(5):985-995.

收藏0 分享0 顶0 踩0